质粒提取简介及问题分析

1、质粒提取简介及问题分析一、导论（一 ） 质粒提取的原理：为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液 I，50 mM 葡萄糖， 25 mM Tris-HCl ，10 mM EDTA ，pH 8.0；溶液 II ， 0.2 N NaOH ，1% SDS；溶液 III ，3 M 醋酸钾， 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应， 首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和 适当 pH 值的 Tris-HCl 溶液， 是再自然不过的了。 那么 50 mM 葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大 的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I 中缺

2、了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA ，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA ，其实也没什么大不了的， 只要是在不太长的时间里完成质粒抽提， 就不用怕 DNA 会迅速被降解， 因为最终溶解质粒的 TE缓冲液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I,可不可以抽质粒呢？只要用等体 积的水或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮

3、均匀，不能有结块。轮到溶液 II 了。这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2%的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱了碱性。很多人不知道 其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞， 碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解， 这是由于细胞膜发生了从 bilayer（ 双 层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难

4、高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒， 因为 SDS 也是碱性的， 只是弱了点而已。 很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀， 这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问， 既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第 一， 时间不能过长，千万不要这时候去接电话， 因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。溶液 III 加入后就会有大量的沉淀， 但大部

5、分人却不明白沉淀的本质。 最容易产生的误解是， 当 SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果这样怀疑，往 1%的 SDS 溶液中加 2M 醋酸溶液看看就知道不是这么回事 了。大量沉淀的出现显然与SDS的加入有关系。如果在溶液 II中不加SDS,也会有少量沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS 不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。 因此高浓度的盐导致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。 这其实是十二烷基硫酸钠 （SDS）遇到钾

6、离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠 杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自 然容易被PDS给共沉淀了，尽管 SDS并不与DNA分子结合。（二）细菌的收获和裂解。细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任

7、意一种，这些方法包括用 非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3 个因素：质粒的大小、 小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒 DNA 的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分 别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1、大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中， 然后用溶菌酶和 EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入 SDS 一类去污剂溶解球形体。这种 方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2、可用更剧烈的方法来分离小

8、质粒。在加入 EDTA 后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂， 通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 DNA 变性，但闭环 质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA 链迅速得到准确 配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3、一些大肠杆菌菌株 （如 HB101 的一些变种衍生株 ） 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类， 当 随后用氯化铯 -溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质 粒 DNA 所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒 DNA 内污染有糖类，而糖类可

9、抑制 多种限制酶的活性。 故从诸 如 HB101 和 TG1 等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。4、当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌菌株 （endA 株，如 HB101） 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸 法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A ，以后在温育 （如用限制酶消化 ）时，质粒 DNA 会被降解。 但如果通过一个附加步骤 （用酚：氯仿进行抽提 ）可以避免此问题。5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而， 某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒 DNA 的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中 所占体积。大量高度粘稠的

10、浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素 可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒 DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细 胞所得到的质粒 DNA 的量大致相等。（三 ）质粒 DNA 的纯化。常用的纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。 如，用氯化铯 -溴化乙 锭梯度平衡离心分离质粒和染色体 DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环 DNA 分子的结合量有所 不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与 DNA 结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA 的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒 DNA 中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度

11、大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每 2 个碱基对大约结合 1 个溴化乙锭分子 ）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA 分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯 - 溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒 DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换 层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。二、质粒 DNA 的小量制备（一）细菌的收获和裂解。1、收获。1）将 2ml 含相应抗生素的 LB 加入到容量为 15ml

12、 并通气良好 （不盖紧 ） 的试管中，然后接入一单菌落， 于30 C剧烈振摇下培养过夜。2）将1.5ml培养物倒入离心管中，4C、12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4C。3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。2、碱法裂解。1）将细菌沉淀，所得重悬于 100 用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。溶液I可成批配制，高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4C。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散。2）加200 新配制的溶液n。盖紧管口，快速颠倒离心管 5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内 表面均与溶液n接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。3）加150 用冰预冷的溶液 川。盖紧管口，将管倒置后温和地振荡1

13、0秒钟溶液川在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3-5 分钟。4）用离心机于4C、12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于 4 C以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。 有些工作者认为不必用酚： 氯仿进行抽提， 然而由于一些未知的原因， 省略这一步， 往往会得到可耐受限制酶切反应的 DNA 。6）用 2 倍体积的乙醇于室温沉淀双锭 DNA 。振荡混合， 于室温放置 2 分钟。7）用微量离心机于 4 C以12 OOOg离心5分钟。8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁

14、的液滴除尽。9）用1ml70%乙醇于4C洗涤双链DNA沉淀，去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。1. 此法制备的高拷贝数质粒 （如Xf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3-5 ygii. 如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1卩DNA溶液加到另一含8卩水的微量离心管内，加1卩l 10限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的 DNA贮存于-20 C。iii. 此方法按适当比例放大可适用于 100ml 细菌培养物： 。3、煮沸裂解。1）将细菌沉淀，所得重悬于 350 卩 ISTET中。STET： 0.1mol/L NaCL , 10mmol/L Tr

15、is.CI（pH8.0） , 1mmol/L EDTA（pH8.0） ， 5% Triton X-100 。2）加25卩新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）配制，振荡3秒钟以混匀之。如 果溶淮中 pH 低于 8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为 40秒。4）用微量离心机于室温以 12000g离心10分种。5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。6）在上清中加入40卩l 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420卩异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。7）用微量离心机于4 C以12 OOOg离心5分种，回收核酸沉淀。

16、8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除 去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管 中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。9）加1ml 70%乙醇，于4 C以12 OOOg离心2分钟。10）按步骤 8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2-5）分钟。 11）用50卩含无DNA酶的胰RNA酶（20卩g/n）的 TE（pH8.0）溶解核酸稍加

17、振荡，贮存于 -20C。 注：当从表达 内切核酸酶 A 的大肠杆菌株 （endA 株，如 HB1O1 ）中小量制粒尤其 DNA 时，建议舍弃煮沸法。因为煮 沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg 2存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤 9）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。（二） 质粒 DNA 小量制备的问题与对策。 碱裂解和煮沸都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有什么麻烦。多年来，在我们实验室中日常 使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：1 、有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割， 这几乎总是由于从

18、细 菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以 去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。2、 在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒 DNA 的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒 已同乙醇一起被弃去。三、质粒 DNA 的大量制备（一） 在丰富培养基中扩增质粒 许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl 或 ColEl 复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml 培养物2-5mg 质粒 DNA ，而且重复性也很好。1）将 30ml

19、含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期 （DNA 600 约0.6）。培养基中应含有相应抗生素， 用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。2）将含相应抗生素的 500ml LB或Terrific肉汤培养基（预加温至37 C ）施放入25ml对数晚期的培养物， 于37C剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分），所得培养物的 OD 600值约为0.4。3) 可做可不做：加 2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使终浓度为170卩g/ml像pBR322 类在宿 主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒 (如 pUC 质粒 )可

20、复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可 大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大 地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯 霉素处理还是利大于弊。4) 于37C剧烈振摇(300转/分)，继续培养12-16小时。(二) 细菌的收获和裂解。1 、收获。1) 4 C以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。2) 将细菌沉淀重悬于 100ml 用冰预冷的 STE 中。STE： 0.1mol/L NaCI ,10mmol/L Tr

21、is-HCI(pH8.0) ,1mmol/L EDTA(pH8.0) 。3) 按步骤 1)所述方法离心，以收集细菌细胞。2、碱裂解法。1) 将冼过的500ml培养物的细菌沉淀物来自收获细菌的步骤 3重悬于10ml(18ml)溶液I中。2) 力口 1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml ,溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。当溶液的pH值低于8.0 时，溶菌酶不能有效工作。3) 加20ml(40ml)新配制的溶液n。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10 分钟。4) 加15nl(20ml)用冰预冷的溶液川。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容

22、物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0C放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。5) 用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以 5000 转/分再度离心 20 分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠 状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液川与细菌裂解物混合不充分步骤4)。6) 上清过滤至一 250ml 离心瓶中，加 0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置 10分钟。7) 用合适转头于室温以 500转/分离心15分钟，回

23、收核酸。如于4C离心，盐也会了生沉淀。8) 小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的 痕量乙醇挥殆尽。9) 用 3ml TE(pH8.0) 溶解核酸沉淀。四、质粒 DNA 的纯化(一) 聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA。1、将核酸溶液所得 转入 15mlCorex 管中， 再加 3ml 用冰预冷的 5mol/L LiCl 溶液，充分混匀，用合 适转头于4 C下以10000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子 RNA。2、 将上清转移到另一 30mlCorex

24、 管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用 SorvallSS34 转头 (或与其相 当的转尖 )于室温以 10 000转/分离心 10分钏， 回收沉淀的核酸。3、 小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁， 流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上 放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。4、用500卩含无DNA酶的胰RNA酶(20卩g/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中， 于室温放置 30 分钟。5、 力口 500 含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1

25、.6mol/L NaCl ,充分混合，用微量离心机于 4 C以12000g 离心 5分钟，以回收质粒 DNA。6、 吸出上清，用400卩l TEpH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。7、 将水相转到另一微量离心管中，加100卩I10mol/L乙醇铵，充分混匀，加 2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4C以12 OOOg离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。8、吸去上清，加 200卩处于4C以12 OOOg离心2分钟。9、 吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500卩I TEPH8.0） 溶解沉淀1：00稀释用TE（pH8

26、.0）后测量0D 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260=5（0 g质粒DNA/ml）, 然后将DNA贮于-20 C。10 、纯化。一些试剂的生化作用原理1、溶液I溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的3-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA :金属离子螯合剂，螯合 Mg2+ , Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶 （DNase）对DNA的降解 作用 （DNase 作用时需要一定的金属离子强度作辅基 ），同时 EDTA 的存在，有利于溶霉菌的作用。因为 溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。2、溶液 n -NaO

27、H-SDS 液NaOH :核酸在pH值为59的溶液中是最稳定的，但 pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键 的解离而变性。在溶液n中的NaOH浓度为0.2N，加入提取液时，该系统的pH就会高达12.6,因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性。SDS:为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白SDS蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但SDS能抑制核糖核酸没的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，以防用RNase去除RNA时受到干扰。3、溶液川-3M KAc（pH4.8）溶液：KAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至

28、 4.8，必须加入大量的冰醋酸，所以该溶液实际上是 KAc-HAc 的 缓冲液。用 pH4.8 的 KAc 溶液是为了把 pH 12.6的抽取液 pH 调回到中性，使变性的质粒 DNA 能够复 性，并能稳定存在。而高盐的 3mol/ LKAc有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA以及SDS-蛋白质复 合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。4、为什么用无水乙醇沉淀 DNA: 此为实验中最常用的沉淀方法。乙醇的优点是低度极性，可以以任意比例和水相混容，乙醇与核酸不会 起任何化学

29、反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液时以水合状态稳定存在的 DNA ，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子， 使 DNA 失 水而易于聚合。 一般实验中， 是加 2倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合。 其乙醇的最终含量占 67%左右。 因而也可改用 95%乙醇来代替无水乙醇 （因无水乙醇价格更贵 ），但加 95%乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中总有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，会影响收得率。折衷 的做法是初次沉淀 DNA 是可用 95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用异 丙醇选择性沉淀 DNA ，一般在室温下放置 1530min 即可。使用乙醇在低温条件下沉淀DNA，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀，且温度越低，DNA沉淀得越快。5、 RNase处理核糖核酸后，再次沉淀DNA时为什么一定要加 NaAc至最