第十三章吸光光度法

1、第一节 吸光光度法的基本原理 第二节 光吸收的基本定律 第三节 吸光光度法分析条件的选择 第四节 分光光度计 第五节 吸光光度法的测定方法 第十三章 吸光光度法 第十三章吸光光度法 吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而 建立的一种分析方法，包括比色法、可见吸光光 度法、紫外吸光光度法和红外光谱法等。 吸光光度法属于仪器分析方法，它所测定的 是物质对光的吸收程度。 吸光光度法主要具有以下特点： （1）测定的灵敏度高。常用于测定质量分数 为 10-3 1 的微量组分，甚至可测定质量分 数低至 10-5 10-4 的痕量组分。 （2）测定的准确度较高。一般吸光光度法测 定的相对误差为 2 5，若使

2、用精密仪器，相 对误差可降至 1 2，完全可以满足微量组分 测定的要求。 第十三章吸光光度法 （3）仪器设备简单，操作简便、快速，选 择性好。由于新的显色剂和掩蔽剂不断发现， 提高了选择性，一般不需分离干扰物质就能进 行测定。 （4）应用广泛。几乎所有的无机离子和具 有共轭双键的有机化合物都可以直接或间接地 用吸光光度法进行测定。 第十三章吸光光度法 第一节 吸光光度法的基本原理 一、光的基本性质 二、物质对光的选择性吸收 三、吸收曲线 第十三章吸光光度法 一、光的基本性质 波谱名称 波长范围 分 析 方 法 射线 0.005 0.17 nm 中子活化分析，穆斯堡尔谱法 X 射线 0.1 10

3、 nm X 射线光谱法 远紫外 10 200 nm 真空紫外光谱法 近紫外 200 400 nm 紫外光谱法 可见光 400 750 nm 比色法，可见吸光光度法 近红外 0.75 2.5红外光谱法 中红外 2.5 50红外光谱法 远红外 50 1000红外光谱法 微 波 1 1000 mm 微波光谱法 射 频 1 1000 m 核磁共振光谱法 m m m 表 13-1 电磁波谱 第十三章吸光光度法 光具有波粒二相性。光的波长、频率 、速率 c、能量 E 之间的关系为： 不同波长的光具有不同的能量，光的波长越短， 光的能量就越大；光的波长越长，光的能量就越小。 /Ehvhc 第十三章吸光光度法

4、 二、物质对光的选择性吸收 人的眼睛能感觉到的光称为可见光，其波长 在 400 760 nm 范围内。通常将具有同一波长的 光称为单色光，由不同波长的单色光组合得到的 光称为复合光。 物质之所以呈现不同的颜色，是由于物质对 不同波长的单色光选择吸收而产生的。当一束白 光通过一有色溶液时，某种波长的单色光被溶液 吸收，而其他波长的单色光透过溶液。因此，溶 液呈现的颜色取决于透过光的颜色。 第十三章吸光光度法 物质的 颜色 吸 收 光 物质的 颜色 吸 收 光 颜色 /nm颜色 /nm 黄绿 紫 400 450紫 黄绿 560 580 黄 蓝 450 480 蓝 黄 580 600 橙 绿蓝 48

5、0 490 绿蓝 橙 600 650 红 蓝绿 490 500 蓝绿 红 650 760 紫红 绿 500 560 如果将两种单色光按适当的比例混合后得到白光， 则这种单色光称为互补色光。显然，透过光和吸收光是 互补色光。 表 13-2 物质的颜色与吸收光颜色的关系 第十三章吸光光度法 三、吸收曲线 如果将不同波长的光通过一定浓度的某一溶 液，分别测定溶液对各种波长的光的吸光度。以 入射光的波长为横坐标，相应的吸光度为纵坐标 作图，可得到一条吸光度随波长变化的曲线，称 为吸收曲线或吸收光谱。 吸收曲线中吸光度最大时所对应的波长称为 最大吸收波长。当溶液的浓度不同时，其吸收曲 线的形状和最大吸收

6、波长的位置不变，只是吸光 度随浓度的增大而增大。 第十三章吸光光度法 KMnO4 的吸收曲线 第十三章吸光光度法 第二节 光吸收的基本定律 一、朗伯-比尔定律 二、偏离朗伯-比尔定律的原因 第十三章吸光光度法 一、朗伯-比尔定律 吸光度和透光率分别定义为： 0 lg I A I 0 I T I 吸光度与透光率的关系为： def def A =lgT 第十三章吸光光度法 1760 年， 朗伯指出： 一束平行单色光通过 有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成 正比。 A = k1 d 1852 年，比尔指出：一束平行单色光通过有 色溶液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。 A = k2 cB

7、将朗伯定律和比尔定律合并起来，就得到朗 伯-比尔定律： B =Ad c 例题 第十三章吸光光度法 例 13-1 用邻菲咯啉法测定铁，已知 Fe2+ 的 质量浓度为 1.010-3 g L-1。用 2 cm 吸收池在波 长 508 nm 处测得吸光度为 0.38，计算铁() -邻菲 咯啉配离子的摩尔吸收系数。 解：Fe3+ 浓度为： 2+3 2+51 2+ (Fe )1.0 10 (Fe )1.8 10 mol L (Fe )55.85 c M 配离子的摩尔吸收系数为： 5 B 521 0.38 1.8 100.20 1.1 10 dmmol A c d 第十三章吸光光度法 若溶液的组成用质量浓

8、度表示，朗伯 - 比尔 定律可表示为： 摩尔吸收系数与吸收系数的关系为： 溶液中含有多种吸光物质时，若吸光物质之 间没有相互作用，则溶液吸光度等于各吸光物质 的吸光度之和： B Aa d B a M 121 122 =+= () iii AAAAdccc 第十三章吸光光度法 二、偏离朗伯-比尔定律的原因 根据朗伯-比尔定律，以 A 为纵坐标，以 cB 或 B 为横坐标作图，应得到一条通过原点的直线。 但在实际测定中，常会出现标准曲线偏离直 线的现象，曲线向上或向下发生弯曲，这种现象 称为偏离朗伯-比尔定律。 第十三章吸光光度法标准曲线 第十三章吸光光度法 标准曲线的偏离 第十三章吸光光度法 1

9、. 非单色光引起的偏离 假设入射光仅由波长为 和 的两种单色 光组成，其强度分别为 I01 和 I02 ，当通过浓度为 cB、厚度为 d 的吸光物质溶液后，透射光的强度 分别为 I1 和 I2。 （一）物理因素引起的偏离 1 2 对波长为 的单色光： 01 11B 1 lg I Adc I 1B 10110 dc II 1 第十三章吸光光度法 对波长为 的单色光： 02 2 2 lg I Adc I 2B 20210 dc II 2B 2 实际测定的是它们的总吸光度 A总。总入射 光强度为 I01I02，总透射光强度为 I1I2 ： 01020102 120102 lglg 1010 dcdc

10、 IIII A IIII 1B2B 总 若12，则有： B 0102 0102 lg ()10 dc II Adc II B总 即总吸光度与浓度仍服从朗伯-比尔定律。 第十三章吸光光度法 上述讨论可能对应以下两种不同的情况： （1） 很小，可近似认为 ， 入射光近似为单色光，故 A 与 cB 仍成正比。 （2）尽管 较大，但在所选择的入射光波长 范围附近吸收曲线较平坦，因此变化较小，故 A 与 cB 仍保持较好的线性关系。 如果 较大时， 不等于 ，则 A 与 cB 不成正比而偏离朗伯-比尔定律， 与 相差越 大，偏离就越显著。通常在最大吸收波长处附近 一小范围内吸收曲线较为平坦， 较小。因此

11、 选择 为入射波长，既有较高灵敏度，又可减 小由非单色引起的偏差。 21 12 1 2 1 2 max 第十三章吸光光度法 2. 非平行入射光引起的偏离 若入射光束为非平行光，就不能保证光束全 部垂直通过吸收池，可能导致光束通过吸收池的 实际平均光程大于吸收池的厚度，使实际测得的 吸光度大于理论值，从而导致与朗伯-比尔定律产 生正偏离。 第十三章吸光光度法 3. 介质不均匀引起的偏离 若溶液中生成溶胶或发生浑浊，当入射光通 过该溶液时，除一部分光被吸光物质吸收外，还 有一部分光被溶胶粒子和粗分散相粒子散射而损 失，使透光率减小，实测的吸光度偏高，从而对 朗伯-比尔定律产生正偏离。 第十三章吸光

12、光度法 1. 溶液浓度过高引起的偏离 若吸光物质溶液的浓度较高时，吸光粒子之 间的相互作用较强，改变了吸光粒子对光的吸收 能力，使溶液的吸光度与溶液浓度之间的线性关 系发生了偏离。 （二）化学因素引起的偏离 第十三章吸光光度法 2. 化学反应引起的偏离 朗伯 - 比尔定律中的浓度是指吸光物质的平 衡浓度，而在实际工作中常用吸光物质的分析浓 度来代替。当吸光物质的平衡浓度等于其分析浓 度或与分析浓度成正比时，A 与 cB 的关系仍服从 朗伯-比尔定律。 被测吸光物质在溶液中常发生缔合、解离、 互变异构、逐级配位等反应，形成新的化合物而 改变了其平衡浓度与分析浓度之间的正比关系， 从而导致偏离朗伯

13、-比尔定律。 第十三章吸光光度法 第三节 吸光光度法分析条件的选择 一、显色反应及其条件 二、测定波长的选择 三、吸光度范围的选择 四、参比溶液的选择 第十三章吸光光度法 一、显色反应及其条件 可见光区的吸光光度法只能用于测定有色 溶液。对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时， 必须加入一种能与被测组分反应生成颜色 较深的有色化合物的试剂，然后再进行测定。 将被测组分转变成有色化合物的化学反应称为 显色反应，能与被测组分反应使之生成有色化 合物的试剂称为显色剂。 第十三章吸光光度法 显色剂必须满足下述条件： （1）灵敏度要高：可见吸光光度法一般用 于微量组分的测定，要求选择的显色剂能与待 测组分

14、生成摩尔吸收系数较大的有色化合物。 生成的有色化合物的摩尔吸收系数越大，对入 射光的吸收程度越大，测定的灵敏度就越高。 （2）选择性要好：选用的显色剂最好只与 待测组分发生显色反应，而与溶液中共存的其 他干扰离子不显色，或者显色剂与被测组分所 生成的有色化合物的颜色和显色剂与干扰离子 所生成有色化合物的颜色有明显的不同。 第十三章吸光光度法 （3）显色剂与被测组分生成的有色化合物 要有足够的稳定性，不易受外界条件的影响而 发生变化。 （4）显色剂与被测组分生成的有色化合物 的组成要恒定，符合一定的化学式，否则测定 的再现性就较差。 （5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长 的差别要足够大，一般要

15、求相差 60 nm 以上。 第十三章吸光光度法 （二）显色条件的选择 1. 显色剂的用量 显色剂的适宜用量常通过实验确定，其方 法是取 7 10 个相同浓度的被测组分的溶液， 并固定其他条件，然后分别在溶液中加入不同 量的显色剂，逐一测定吸光度，绘制吸光度 A 与显色剂浓度 cB 的关系曲线。 第十三章吸光光度法 吸光度与显色剂用量的关系 cB 第十三章吸光光度法 2. 溶液的酸度 溶液的酸度对显色反应的影响： （1）对被测组分存在状态的影响：大多数 被测金属离子易水解，当溶液 pH 增大时，可 能生成各种类型的氢氧基配合物，甚至生成氢 氧化物沉淀，使显色反应不能进行完全。 （2）对显色剂平衡

16、浓度和颜色的影响：大 多数的显色剂是有机弱酸或有机弱碱，当溶液 的 pH 变化时，将影响显色剂的平衡浓度，并 影响显色反应的完全程度。另外，有一些显色 剂本身就是酸碱指示剂，它们在不同 pH 的溶 液中具有不同的结构，而产生不同的颜色，所 以对显色反应也有影响。 第十三章吸光光度法 （3）对有色化合物组成的影响：在不同 pH 的溶液中，显色剂与待测离子形成的有色化合物 的组成往往不同，其颜色也不同。必须控制合适 的 pH，才能获得好的分析结果。 不同的显色反应的适宜 pH 是通过实验确定 的。具体方法是: 固定溶液中被测组分和显色剂 的浓度， 改变浓度的 pH ，测定此 pH 下溶液的 吸光度

17、， 以 pH 为横坐标， 以吸光度为纵坐标， 作出 pH 与吸光度的关系曲线，从中可找出适宜 的 pH 范围。 第十三章吸光光度法 吸光度与溶液 pH 的关系 第十三章吸光光度法 3. 显色温度 显色反应一般在室温下进行，但有些显色反 应需要加热到一定温度时才能完成，而有些有色 化合物当温度较高时又容易发生分解。对不同的 显色反应，应通过实验找出其最佳温度范围。 4. 显色时间 可通过实验来确定合适的测定时间。实验的 方法是配制一份待测溶液，从加入显色剂起计算 时间，每隔几分钟测定一次吸光度，绘制 A-t 关 系曲线，根据曲线选择合适的测定时间。 第十三章吸光光度法 二、测定波长的选择 选择溶

18、液具有最大吸收的波长 max 作为入 射波长。在max处 最大，使测定具有较高的灵 敏度；同时，在max处的一个较小范围内，吸光 度变化较小，不会偏离朗伯 - 比尔定律，也使测 定具有较高的准确度。如果干扰物质在max处也 有强烈吸收时，可选用非最大吸收处的波长，但 应尽可能选择吸光度随波长改变而变化不大的区 域内的波长。 第十三章吸光光度法 三、吸光度范围的选择 在吸光光度分析中，分光光度计的读数误 差也是测定误差的主要来源之一。对于同一台 仪器，透光率读数的绝对误差 基本上为一 定值。 由于透光率 T 与试样溶液浓度 cB 之间为 对数关系，因而在不同的透光率读数范围内， 这一恒定误差 所

19、引起的浓度 cB 的测定的相 对误差是不同的。 T T 第十三章吸光光度法 B 0.434d dlgd T Td c T 以上两式相除： B B d0.434d lg cT cTT 上式可改写成： B B 0.434 lg cT cTT 根据朗伯-比尔定律： B lgTAdc 当 d 为定值时，将上式微分： 第十三章吸光光度法 测定误差与透光率的关系 T/% 第十三章吸光光度法 在 T = 36.8 % (A = 0.434) 时，浓度测定的相对误 差最小。 在实际测定时，常将吸光度控制在 0.2 0.7 (T = 20% 65%) 之间，以减小浓度测定的相对误差。 表 13-3 不同透光率时

20、测定浓度的相对 误差cB/cB(T = 0.01) T/% 9590 80 70 60 50 36.83020 10 5 2 20.6 10.7 5.6 4.0 3.3 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 13.0 BB (/)/% c c 第十三章吸光光度法 四、参比溶液的选择 选择参比溶液的原则如下： （1）如果仅待测组分与显色剂的反应产物有 吸收，可用纯溶剂作参比溶液。 （2）如果显色剂或其他试剂略有吸收，可用 不含待测组分的试剂溶液作参比溶液。 （3）如果试样中的其他组分也有吸收， 但不 与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样 溶液作参比溶液；当显色剂略有吸收时，可在试

21、 液中加入适当掩蔽剂，将待测组分掩蔽后，再加 入显色剂，以此溶液作参比溶液。 第十三章吸光光度法 第四节 分光光度计 一、基本部件及性能 二、几种常用的分光光度计 第十三章吸光光度法 一、基本部件及性能 分光光度计的基本组成部件为： 光源 色器吸收池 指示器 在可见光区测定时，常用钨灯或碘钨灯作光源，它 发出波长为 320 2500 nm 范围内的连续光谱。 （一）光源 单检测系统读数 第十三章吸光光度法 单色器是将光源发出的连续光谱分解为单 色光的装置。单色器由棱镜或光栅等色散元件 及狭缝和透镜等组成。 （1）棱镜：棱镜是根据光的折射原理，将 复合光色散分为不同波长的单色光，然后再让 所需波

22、长的光通过一个很窄的出射狭缝照射到 吸收池上。 （2）光栅：光栅是根据光的衍射和干涉原 理来达到色散目的。光栅的分辨率比棱镜高， 适用波长范围宽 ，而且色散均匀。 （二）单色器 第十三章吸光光度法 （三）吸收池 吸收池是用光学玻璃或石英制成的无色透 明的长方体容器，用于盛放参比溶液或待测溶 液。在可见光区测定时，使用玻璃吸收池。 利用光电效应将透射光强度转换为电流进 行测定的光电转换部件称为检测器。可见分光 光度计常用的检测器有光电池、光电管和光电 倍增管。 （四）检测系统 第十三章吸光光度法 （1）光电池：常用的光电池是硒光电池， 当光照射在光电池上时，半导体硒表面就有电 子逸出，被收集于金

23、属薄膜上，因此带负电， 成为光电池的负极。由于硒的半导体性质，电 子只能单向移动，使铁片成为正极。通过与电 阻很小的外电路连接，能产生 10 100 的光 电流，可直接用检流计测定，电流大小与照射 光强度成正比。 A 第十三章吸光光度法 （2）光电管：光电管是由一个阳极和光敏 阴极组成的真空（或充有少量惰性气体）二极 管，阴极表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光 敏材料，当它被具有足够能量的光照射时，能 够发射电子。当两极间有电位差时，发射出的 电子就流向阳极而产生电流，电流的大小取决 于入射光的强度。 第十三章吸光光度法 （3）光电倍增管：光电倍增管中有一个光敏 阴极和若干个倍增光敏阴极，当光照

24、射光敏阴极 时发射出电子，由于外电场的加速作用，这些电 子高速轰击相邻的第一阴极，该阴极经电子轰击 后又产生次级电子，其数目较入射的电子多，这 些电子再次被加速轰击第二阴极，从而发射出更 多的电子。通常使用 9 12 个这种阴极，可将电 流放大几百万倍以上。最后倍增了电子射向阳极 形成电流，光电流通过负载电阻变成电压信号， 经放大后将信号输入读数指示器。 第十三章吸光光度法 （五）读数指示器 读数指示器的作用是把光电流放大的信号 以适当方式显示或记录下来。通常使用悬镜式 光电反射检流计测定产生的光电流。检流计光 点偏转刻度直接标为吸光度和透光率，测定时 可直接读出。 第十三章吸光光度法 二、几种