引物纯化方式选择指南

1、内容导读一、DNA 合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、DNA 合成的方法和原理 目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。 基于该方法的 DNA 合成仪有多种， 由 ABI/PE 公司生产的高通量 DNA 自动合成仪得到了广泛的应用。 各合成仪进行引物合成的原理基本相同， 主要区别在于合成产率的高低、 试剂消耗量和单个循环用时等。 生工公司采用的合成仪主要机型 为全新的 ABI3900 高通量合成仪。固相亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合

2、成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从53方向延伸，而是由 3端开始，相邻的核苷酸通过3t 5磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。1、脱保护基 (Deblocking) 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid ， TCA) 脱去连结在 CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷 酸的保护基团 DMT ( 二甲氧基三苯甲基 )，获得游离的 5-羟基端，以供下一步缩合反应。2 、活化 (Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其 3-端已被活化，但 5-端仍受 DMT 保护 )，此

3、中间体将与 GPG 上的已脱保护基的核苷酸发生 缩合反应。3 、连接 (Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到 CPG 上已脱保护基的核苷酸时， 将与其 5-羟基发生亲合反应， 缩 合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。4 、封闭 (Capping)缩合反应后， 为了防止连在 CPG 上的未参与反应的 5-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。图 1: DNA 合成原理示意图(固相亚磷酰胺三酯法)5 、氧化 (Oxidation)缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在 CPG 上的寡核苷酸连接， 而亚

4、磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到 CPG 的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去 新连上的脱氧核苷酸 5-羟基上的保护基团 DMT 后，重复以上的活化、 连接、封闭、 氧化过程即 可得到DNA片段粗品。最后对其进行切割、 脱保护基，合成的Oligo在脱去保护基后，目的Oligo纯度是比较低的， 其中含有大量的杂质。 主要杂质有： 所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异 丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基，以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长Oligo DNA含量仅为25%左右。尽管合成时每一步的

5、效率都在98%99%，但累积的效率并不高。这些杂质成分，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，不但造成定量不准，还会影响下一步的反应。 因此必须对 Oligo DNA 进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。二、引物纯化的方法原理及其效果基于以上合成的原理和步骤， 目前， 常见的几种纯化方法如 C18 柱、 OPC 或 HAP、 PAGE 、 HPLC 。生工公司采用 HAP 、 ULTRA PAGE 、 HPLC 三种纯化方法，其纯化的原理及其效果分 别如下，我们建议客户应根据不同的实验需求，选择合适、经济并有效的纯化方法。1. HAP 纯化方法HAP （ HighAff

6、inityPurification ）是生工生物自主开发的新型 oligoDNA 纯化方法。该方法已 取得国家专利（专利号： 200310208040.X ）。其原理是利用合成引物 5- 端 DMT 基团对 HAP 树脂专一性吸附，而不含 DMT 的短链 DNA 不被吸附，从而达到分离纯化的目的。HAP 纯化 柱中装有对 DMT 具有亲和力的树脂，合成 DNA 片段时保留 5端最后一个碱基 上的 DMT ，所有合成产物吸附在柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有 DMT 的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA 或三氯乙酸 TCA 脱去 DMT 基

7、团，再用浓一点的有机溶剂洗脱 DNA 。这种方法具有多快好省的特点。 制品纯度可达到 8090% ， 可以满足杂交 探针 、 测序 、常规 PCR （不再做进一步克隆实验）等 用途了。但是因为其专一性吸附 DMT 能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量 小。特别是对长于 39 碱基以上的片段纯化效果不好。此 级别只提供长度在 10-39mer 以下的合 成 oligo DNA 制品。序列更长时，制品的纯度得不到保证。若考虑节约经费，对于要求较低的实 验，如简单的 PCR 反应，则采用 HAP 纯化即可。2. ULTRA PAGE 纯化方法PAGE （Polyacrylamide Ge

8、l Electrophoresis） ，该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA 片段进行分离， 然后从凝胶中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 纯化基于尺寸和构象分离全长 产物和失败序列，可以分离相差一个碱基的引物 （120 碱基以内 ），从而提供高纯度的引物。纯化 后的 DNA 纯度大于 90%，相比与其他两种方法， PAGE 纯化对长链 Oligo DNA （ 大于 50 mer） 的纯化特别有效，制品纯度保证 90 95% 。如订购的 DNA 欲用作 RT-PCR 引物、各种探针， 或用于 PCR 克隆测序、定点突变等，请选用 PAGE 纯化制品。ULTRA PAGE :理论上

9、分析型 PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。经过 PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，上样量都是非常大，电泳时的条带往往比较宽，带与带之间有重叠，分辨率有所下降，电泳后割带回收目的引物时，导致割的条带有时可能比较宽，很难避免割到差别仅一个或几个碱基的引物。因此生工生物为了给客户更好解决以上问题，将原有的 PAGE纯化方式升级优化为现在的 ULTRA PAGE 纯化方式，即在 PAGE纯化的 同时配合质谱对 DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。3. HPLC纯化方法HPLC （High Performa nee Liquid Chromatography）是使用

10、高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度，可以有效的去除大部分 N-短片段，因而可以除去失败序列或未结合的标记物，从而对DNA片段进行纯化。同时配合质谱对 DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。由于HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。主要用于PCR克隆、定点突变、人工合成基因、长链和修饰引物的纯化等。它的优点是自动化程度

11、高、省人力；弱点是纯化量通量小、成本较高。三、纯化方法与应用指南表1: HAP、ULTRA PAGE 和HPLC 三种纯化方法的特点比较纯化方式纯化原理优缺点应用HAP采用纯化柱上特异性树脂对DNA片段上保留 5端最后 一个碱基上的 DMT有亲和 吸附作用从而达到分离纯 化。多快好省的特点。纯度可达到8090%，但是对长于40碱基以上的片 段纯化效果不好。可以满足杂交探 针、测序、常规 PCR （不再做进一 步克隆实验）等用 途。ULTRA PAGE采用变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳，基于凝胶的尺寸和 DNA 的构象原理，可以分离相差 一个碱基的引物，从而达到 对全长产物和失败序列进行 分离，然后从

12、凝胶中回收目 的DNA ,同时配合质谱对 DNA进行定性分析，以保证 回收片段的正确性。纯度好，准确性高，对于较长 序列（40-120 ），制品纯度 保证9095%，相比与其他两 种方法，ULTRA PAGE 纯化 对长链引物（大于50mer）的 纯化特别有效，缺点需要跑电 泳并切胶回收，费时费力。可适于多重PCR、 亚克隆、点突变、 各种探针，或用于 PCR克隆测序、定 点突变等。HPLC采用高效液相色谱的原理， 依据DNA的疏水性来分离 产物的。合成粗产物中不同 长度的DNA片段的疏水 性不同，一般来说较长的片 段具有较强的疏水性，同时 配合质谱对DNA进行定性 分析，以保证回收片段的正

13、确性。该法自动化程度高、省人力； 对于较长片段（大于89 mer）， 纯化效果不如 ULTRA PAGE 方法好。尽管对于较长序列， 但如果实验对制品的纯度要 求非常高， HPLC 与ULTRA PAGE双重精制会使效果更 佳，其弱点是纯化通量小、成 本较高。因其HPLC产品的 纯度非常高，使用 本法纯化的 DNA 制品可适用于各 种基因工程实验。主要用于PCR克 隆、定点突变、人 工合成基因、长链 和修饰引物的纯 化。对40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法， 其次是ULTRA PAGE ；而对40 mer 以上的DNA制品ULTRA PAGE 纯化要优于单纯的 HPLC纯化

14、。所以，如您要对 PCR产物 克隆后测序，一定要选择 ULTRA PAGE 纯化或HPLC纯化的引物。根据不同的实验要求，您可以选用以下适合的纯化方法，具体见表2表2: HAP、ULTRA PAGE 和HPLC 三种纯化方法的应用应用引物长度要求纯化方法要求普通 PCR/RT-PCR40baseULTRA PAGE多重PCR/定量 PCR根据实验要求定ULTRA PAGE, HPLC测序根据实验要求定HAP诊断PCR扩增根据实验要求定HAP, ULTRA PAGE亚克隆，点突变根据实验要求定ULTRA PAGE, HPLC基因构建根据实验要求定ULTRA PAGE, HPLC全基因合成根据实验

15、要求定HAP反义核酸根据实验要求定HPLC修饰/标记引物根据实验要求定HPLCPCR产物用于克隆表达研究或 基因重组等根据实验要求定ULTRA PAGE, HPLC四、常见问题的原因分析及相应的对策Q-1.拿到引物后，想在实验室检测纯度，如何实现？A-1:实验室可通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行引物纯度的检测：使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，碱基数 12个的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，60个碱基的引物用12%的胶。取0.2-0.5 OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95 C，2 min ）。加入尿素的目的一是变性，

16、二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光 TLC板在紫外灯下检测带型，在主带结构条带)Q-2. 测序发现引物有突变或缺失是什么原因？A-2: 测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：测序， PCR/ 克隆过程，引物本身。A、测序引入的错误对于 PCR 产物进行的克隆而言，无论是 TA 克隆或酶切克隆，引物区往往位于载体两端， 如果用载体引物进行测序， 此时克隆引物区离测序引物区的距离比较近， 处于测序起始阶段或正 好处于测序染料峰所在的区域内( 90-120 bp )，这两个区域也是最容易产生测序错误的地方。 因此，首先要看原始的测序峰图

17、在引物区内是否清晰， 碱基的错误或缺失是否是由于峰图不清楚 而导致的计算机误读。B 、 PCR/ 克隆过程尽管使用高保真聚合酶进行 PCR 出错的可能性比较少， 但不排除 PCR 错配或者克隆过程中 突变的可能。有的人会问， PCR 的突变怎么会出现在引物区呢？这是因为，引物是单链，PCR产物引物区的互补链同样是以引物为模板进行扩增得到的，因此，有可能存在引物正确但其产物出错的情况。针对这种情况的解决方法是进行测序时，请送 2-3 个独立的克隆子进行测序，这样可以排除PCR 过程出错或克隆产生突变的情况。C、引物本身错误如前面所述，引物合成是一种多步骤的化学反应，即使每一步合成效率达到99%

18、，仍有 1%的序列不能连接或错误地连接下一个碱基，这些序列在经过Capping 后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；对于 缺失突变 ，一般认为是一般认为是带帽 (capping) 反应不彻底造成的， Caping 反应主要 是封闭极少数 5-羟基没有参加反应单体。 被封闭的引物， 在下一轮偶连时将不能继续参与合成。 对于实验中测序发现的较常见碱基缺失的可能原因如下：1. 由于DNA合成是沿着3 f 5端方向将碱基逐个连接上去的，每连上一 个碱基，都需要经过 (Detritylation 、 Coupling 、 Capping 、 Oxidation) 一个循环。 Coupling 是上一个碱基

19、的 5-OH 与 下一个碱基的 3 活性部分发生反应，该反应的效率最高可达 99% ，即便如此， 仍有 1%的序列不能连接下一个碱基，这些序列在经过 Capping 后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；2. Capping 是将没有连接上下一个碱基的 5-OH 乙酰化， Capping 的效率不可能达到 100% ， 没有被乙酰化的 5OH 会进一步发生反应，造成中间缺碱基的失败序列；3. Detritylation 是脱掉上一个碱基 5-OH 上的保护基，准备连接下一个新碱基， Detritylation 的效率也不可能达到 100% ，没有脱保护的 5-OH 会跳过该循环而直接进入下一个循环

20、， 造成中 间缺碱基的失败序列；至于 插入突变 ，引物序列中往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分碱基 发生丢失 DMT ，处于活性状态的新碱基在没有与上一个碱基反应前发生自连，将会造成碱基重 复，故会发生插入同一碱基的突变的失败序列。对于碱基置换的突变 ，产生的原因一般认为是碱基不能 100% 脱保护，即引物上可能含有残 留保护基团，通常发生在 G 转换成其它碱基。碱基 G 在一定条件下可以转化为烯醇异构体 2,6-diaminopurine （脱嘌呤）， DNA 复制和 PCR 过程中 DNA 聚合酶将 2,6-diaminopurine 看 作碱基 A ，发生 G 到 A

21、的转换，测序就会发现碱基 G-A 置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中 发生的频率较高。引物合成过程中，造成碱基缺失，插入，置换突变的因素客观存在，上述各种原因产生的失 败序列可通过纯化不同程度地得到去除。但是基于目前大规模生产的纯化方法，还不能达到 100% 的纯度，对 40 mer 以下的 DNA 制品， HPLC 是最好的纯化方法，其次是 ULTRA PAGE 而对 40 mer 以上的 DNA 制品 ULTRAPAGE 纯化要优于单纯的 HPLC 纯化。所以，如您要对 PCR 产物克隆后测序，一定要选择 ULTRA PAGE 纯化或 HPLC 纯化的引物。测序发现引物区域有突变，特别是

22、40 个碱基以下的引物 , 发生的概率不大，但是偶尔也会 发生。 客户一般可以放心， 引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列复制到合成仪的， 人为造 成的序列出错可能微乎其微。 在目前的技术水平下， 各家公司还没有办法彻底解决引物合成出错 的这个问题。 引物合成的固相合成原理都一样， 采用的机器也基本相同， 合成主要原料都是由可 数的几家跨国公司提供的， 所以每个合成服务商遇到的问题也基本类似， 没有哪家公司可以完全 避免。Q-3. 长链引物为什么出错的几率非常高？A-3:引物合成时，每一步反应效率都不能达到100% ，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。 引物链越长， 出

23、错的频率累加起来就越高。 客户总希望合成的引物完全正 确，这种心情可以理解。但是正像 PCR 扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成 也不可能保证 100% 正确。通常引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温 聚合酶 PCR 扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，特别是长链引物合成，出了建议选择准备。Q-4. 如何能保证引物的正确性A-4:1. 订购引物时，选用高纯度级纯化方法。2. 最好选用小于 40 个碱基的引物。3. 克隆实验时，一定要选择 ULTRA PAGE 纯化或 HPLC 纯化的引物。并且每次克隆都须 进行测序验证，以保证序列的正确性， 然后再进行进一步实验。 进行蛋白表达实验时， 尤其需要Q-5. PCR 产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误， 怎么办 ?A-5:1. 遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是 核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。2. 如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆 的。因为引物纯度不可能是 100% ，因此，挑选克隆时，有可