基于母源抗体的青海湖鸟岛斑头雁H5N1禽流感病毒

1、分类号 密级 udc 编号 中国科学院研究生院 硕士学位论文 青海湖斑头雁青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 朱 筱 佳 指导教师： 李 来 兴 副研究员 中国科学院西北高原生物研究所 申请学位级别： 硕士 学科专业名称： 动物学 论文提交日期： 2009 年 6 月 论文答辩日期： 2009 年 6 月 培养单位： 中国科学院西北高原生物研究所 学位授予单位： 中国科学院研究生院 答辩委员会主席： 张迎梅 thesis of master degree, graduate school of the chinese acade

2、my of sciences the detection of anti-h5n1-aiv maternal antibody and evaluation of immunocompetence of bar-headed geese of qinghai lake xiaojia zhu (zoology) directed by associate professor laixing li northwest institute of plateau biology, cas june, 2009, xining, qinghai, china 中文摘要 i 中文摘要 禽流感（avian

3、 influenza，ai）是由正粘病毒科a型流感病毒引起的一种禽类的 烈性传染病。2005年，青海湖国家级自然保护区野生鸟类种群首次暴发h5n1型高 致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, hpai） ，死亡数量6000余只（12种） ，其中数量最多的是斑头雁（anser indicus） 。自此，野生迁徙鸟类，尤其是鸭科鸟 类（anatidae）的禽流感病毒携带和感染情况在世界范围内引起了人们的广泛关注。 由于野生迁徙鸟类禽流感的暴发，涉及迁徙鸟类在不同国家和地理区域之间活动， 容易引起病毒的传播和再次流行。目前，对野生鸟类禽流感的监测引起了各国

4、政府 和人民的高度重视。 本实验通过母源抗体检测对青海湖鸟岛斑头雁种群的禽流感病毒感染和免疫力 获得状况进行评估。实验以孵化后期的卵黄母源抗体水平反映亲鸟种群的禽流感病 毒感染状况为理论基础，设计了通过收集弃卵和巢卵进行人工孵化，取孵化后期的 卵黄检测对 h5n1 亚型禽流感的母源抗体水平。研究发现，收集 85 个巢卵（弃卵 85 枚，巢卵 149 枚）进行卵黄母源抗体检测，血凝抑制试验表明，母体种群分别有 26.5%（弃卵）或 35.2%（巢卵）的繁殖对（breeding pairs）对 h5n1 亚型禽流感病 毒（avian influenza virus, aiv）的母源抗体呈现阳性；酶

5、联免疫吸附实验结果表明， 母体种群分别有 12.5%（弃卵）或 13.2%（巢卵）繁殖对的 h5n1 亚型禽流感病毒 的母源抗体呈现阳性。此外，以种群繁殖密度和巢卵抗体效价进行相关性分析，发 现青海湖鸟岛斑头雁种群局部高密度地区巢卵的母源抗体水平与繁殖密度正相关。 经过对在青海湖自然保护区繁殖的斑头雁种群的 h5n1 亚型高致病性禽流感母 源抗体检测，表明繁殖群中有一定比例的斑头雁在 2008 年迁徙到青海湖繁殖地之 前感染过 h5n1 亚型禽流感病毒且经历获得性免疫，以母源抗体的形式传递给了尚 未具有自身免疫能力的幼鸟，使种群对 h5n1 亚型 hpai 病毒具有了一定的免疫能 力。因此，青

6、海湖鸟岛斑头雁种群再次被这一病原体感染的风险大大降低（除非病 原体出现变异） ，在一定程度上提高了繁殖率和子代的存活率。繁殖密度和巢卵效 价的正相关结果表明，繁殖密度高的区域，种群免疫力也相对较强。以巢密度为表 征的繁殖密度可能是集群水鸟种群病原体感染的一个影响因素。在自然保护区管理 中，可以考虑以改善集群水鸟的栖息地环境使其局域的繁殖密度降低，从而降低病 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 ii 原体入侵种群的风险。 关键词：h5n1；禽流感；斑头雁；人工孵化；母源抗体；血凝抑制；酶联免疫吸 附 英文摘要 iii abstract avian influenza

7、(ai) is a severe infectious disease of birds caused by influenza a virus, a member of the family orthomyxoviridae. in 2005, first h5n1 highly pathogenic avian influenza (hpai) in wild birds broke out in qinghai lake national natural reserve. the dead birds contained 12 species, totaled more than 600

8、0 individuals, the most dead is bar-headed goose (anser indicus). since then, increasing concern has developed over the situation of ai carried and infected in migratory birds, especially mallard duck (anatidae). as the outbreak of hpai in migratory birds involves their migration across various coun

9、tries and geographic areas, it is likely to cause spread and prevalence of aiv. so far, the monitoring of aiv (avian influenza virus) in wild birds aroused serious attentions of governments and people worldwide. the purpose of our research is to detect and evaluate the infection and immunocompetence

10、 of h5n1 aiv in bar-headed geese of island birds in lake qinghai on maternal antibody (mab) transmission. based on the theory that maternal antibody in yolk of late hatching period reflects the infection of particular pathogen in maternal populations, the collected 85 ejected eggs and 149 nest eggs

11、of the bar-headed geese were put into artificial hatching, then the yolk maternal antibodies to h5n1 aiv detected. the results of hi (hemagglutinin inhibition) indicated the positive antibody rates to h5n1 aiv of ejected eggs and nest eggs were 26.5% and 35.2% respectively. meanwhile, the results of

12、 celisa (competitive enzyme linked immunosorbent assay) indicated the positive rates of two groups were 12.5% and 13.2% respectively. in addition, with the correlation analysis of neighbored nests density and mab concentrations of nest eggs, we found in the bar-headed geese, yolk mab concentrations

13、are positively correlated with local breeding density. with the detection of anti-h5n1-aiv mab of bar-headed geese breeding in qinghai lake natural reserve, we found a certain proportions of bar-headed geese of the breeding colony had been infected h5n1 hpai virus before they migrated to island bird

14、, lake qinghai in 2008. and after specific acquired immune responses, they transmitted 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 iv antigen-specific mab to immunologically nave neonates to make them passively acquire maternal aiv antibodies and acquire certain immunocompetence to h5n1 hpai virus. furthermore,

15、 unless mutation of the aiv, it greatly reduced the risk of h5n1 aiv re- infection, and increased the reproductive success and survival probability of the bar- headed geese to a certain extent. the positive correlation of breeding density and mab concentrations indicated, the bar-headed geese at hig

16、h local density acquired relatively higher immunocompetence. the breeding density indicated by nest density may be an influencing factor on the pathogenic infection of colonial breeding waterbirds. in the management of natural reserve, it might be considered to improve habitat conditions of colonial

17、 breeding waterbirds to lower their local breeding density in order to reduce the risk of pathogen invasion accordingly. key words: h5n1; avian influenza; bar-headed goose; artificial hatching; maternal antibody; hemagglutinin inhibition; enzyme linked immunosorbent assay 目录 i 目 录 引引 言言.1 第一部分第一部分 文

18、献综述文献综述.4 第一章第一章 野生鸟类野生鸟类 h5n1 禽流感监测的研究进展禽流感监测的研究进展.4 1.1 高致病性禽流感在野生鸟类的暴发及影响.4 1.2 对野生鸟类种群携带禽流感等疫源性病原体的检测技术进展.7 1.2.1 野生鸟类种群免疫力检测技术进展.7 1.2.2 禽流感检测技术进展.8 1.3 鸟类母源抗体及其应用.9 1.3.1 母源抗体.9 1.3.2 母源抗体传递过程及机理.10 1.3.3 鸟类母源抗体传递与疾病防御.12 1.3.4 母源抗体的研究意义和在生产实践中的应用.13 1.4 野生鸟类禽流感监测研究.14 1.4.1 监测方法研究进展.14 1.4.2检

19、测程序和监测网络的建立.15 第二部分第二部分 青海湖鸟岛斑头雁种群青海湖鸟岛斑头雁种群 h5n1 亚型禽流感母源抗体研究亚型禽流感母源抗体研究.16 第二章第二章 青海湖鸟岛斑头雁行为观察与样本采集青海湖鸟岛斑头雁行为观察与样本采集.16 2.1 斑头雁弃卵行为观察.16 2.2 斑头雁卵的收集.17 2.3 讨论.17 第三章第三章 青海湖鸟岛斑头雁的人工孵化青海湖鸟岛斑头雁的人工孵化.20 3.1 孵化前的准备.20 3.2 孵化设备.20 3.3 入孵及孵化过程监控.20 3.4 孵化结果统计.25 3.5 讨论.25 第四章第四章 青海湖鸟岛斑头雁母源抗体水平测试青海湖鸟岛斑头雁母源

20、抗体水平测试.28 4.1 卵黄母源抗体取样.28 4.2 植物血凝素肿胀测试（pha-induced skin swelling）预试验 .29 4.3 血凝抑制试验（hi）检测卵黄母源抗体.30 4.4 竞争性酶联免疫吸附试验（c-elisa）检测卵黄母源抗体.33 4.5 检测结果统计.36 4.5.1 弃卵和巢卵的mab阳性率比较.36 4.5.2 弃卵和巢卵的mab效价比较.37 4.5.3 母源抗体水平和繁殖密度.38 4.6 讨论.39 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 ii 第五章第五章 青海湖斑头雁禽流感监测方案的初步建立青海湖斑头雁禽流感监测方

21、案的初步建立.42 5.1 基于母源抗体的野生鸟类禽流感监测的理论意义.42 5.2 基于母源抗体的野生鸟类禽流感监测的实践意义.42 5.3 青海湖斑头雁种群 h5n1 亚型 aiv 母源抗体检测方法.43 5.4 青海湖斑头雁禽流感监测预案.44 5.4.1 监测现状及新方案.44 5.4.2 监测预案步骤.44 5.5 讨论.44 第六章第六章 结结 论论.47 参考文献参考文献.49 硕士期间发表论文、参与课题及获奖情况硕士期间发表论文、参与课题及获奖情况.56 致致 谢谢.57 独独 创创 性性 说说 明明.58 引言 1 引 言 青海湖，中国最大的内陆咸水湖，是全球八条候鸟迁徙路径

22、中“中亚-印度”路 线的重要组成部分。以青海湖为核心的青海湖国家级自然保护区，地处青藏高原东 北部，祁连山系南麓 (n36313715，e993410048，湖面 3193m a.s.l)，总 面积 4952km2（包括青海湖整个水域及鸟类栖息的岛屿和湖岸湿地） ，1992 年被列 入关于特别是作为水禽栖息地的国际重要湿地公约（拉姆萨公约） 国际重要湿 地名录。青海湖自然保护区，属于湿地生态系统和野生动物类型的自然保护区，生 物多样性丰富，面临着复杂的社会经济和生态问题1, 2。位于青海湖西端的鸟岛： 又名海西皮或蛋岛（n3658，e9952，3200m a.s.l.） ，面积 0.22km2

23、，位于布哈河 口以北 4km 处，鸟岛在 1959 年初次报道时，四面环水，岛的东南头大，向西北突 然变狭窄延长，整个岛屿形似蝌蚪，全长 1500m，有普通鸬鹚（phalacrocorax carbo） 、斑头雁（anser indicus） 、渔鸥（larus ichthyaetus）和棕头鸥（larus brunnicephalus）4 种水鸟在此集群营巢繁殖3。1978 年以后，由于青海湖水位下降 和风沙堆积等，鸟岛的东、北、西三面湖底外露与陆地连在一起，只有南边濒临青 海湖水，鸟岛成为湖岸的一个高台。这一高台的临水南坡，坡度平缓，地表由沙土、 石砾覆盖，与海水交界处是一片滩涂，其中有几

24、处泉水涌流，现在是斑头雁和棕头 鸥的集群营巢繁殖地。 斑头雁（anser indicus） ，早成鸟，于亚洲南部低地越冬，喜马拉雅北部高地湖 泊和河流繁殖，集群营巢于小型岛屿，相邻巢间的距离不超过 1m，有野外研究观 察到斑头雁种群在高密度繁殖区域的分散于巢间的卵4。中国动物志记载5，斑头 雁，青海湖夏候鸟，单配制，集群繁殖，最早 3 月 20 日迁来繁殖；营巢最早开始 于 4 月上旬，一般在 4 月中旬左右；营巢后 10-12 天开始产卵，窝卵数 2-8 枚，少 数 10 枚以上，通常以 4-6 枚为最多；产卵期中，雌雁每隔一天产卵一枚，整窝卵全 部产出需时 4-16 天；孵卵 29 天出雏

25、。 集群繁殖种群有利于群体中个体提高捕食效率和抵御被捕食的风险，而繁殖季 节大量的个体聚集同样增加了病原体感染的风险，包括病原微生物入侵的机会6。 在这种生存压力下，亲鸟通过母源抗体传递将其病原体特异性的获得性免疫能力传 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 2 递给子代，从而保证子代的存活7。母源抗体的传递历程表明，雏鸟出壳前 5-6 天 的卵黄母源抗体或出壳后 5 天内雏鸟的母源抗体水平代表了母体的获得性免疫抗体 水平，子代的母源抗体水平可以在一定程度上反应亲鸟的特异性病原体感染及在其 繁殖环境中的病原体状况8。母源抗体传递可以作为一种重塑幼鸟表型以适应当地 病原

26、体环境的特殊途径，而种群繁殖密度的变化会使母源抗体传递随繁殖群内巢位 的不同而发生改变5。亲鸟的这种传递能力是提高子代存活率，进而提高种群繁殖 率的一个重要途径，具有重要的进化意义，同时由于母源抗体是母体种群对其繁殖 环境中最具威胁的病原体做出的直接反映，因而具有重要的病原体环境指示意义。 野生鸟类是低致病性禽流感病毒(lowly pathogenic avian influenza, lpai)的自然 宿主，其中雁形目（anseriformes）和鸻行目（charadriiformes）是携带病毒最多的 鸟类9。2005 年，h5n1 亚型高致病性禽流感(highly pathogenic

27、avian influenza, hpai)首次暴发于青海湖国家级自然保护区的野生迁徙水鸟，其中死亡数量最多的 是斑头雁种群10。为了评估这次重大 h5n1 亚型禽流感暴发事件对栖息在青海湖鸟 岛斑头雁种群的冲击和此后斑头雁种群对 h5n1 亚型禽流感病毒（aiv）的免疫力 获得情况，国内外科学家在青海湖地区进行了大量的研究调查，使青海湖鸟岛成为 野生鸟类禽流感研究的热点地区之一。然而，由于对野生水鸟的捕捉相对困难，同 时作为研究对象的各水鸟繁殖群均处在国际重要湿地和国家级自然保护区的核心区 内，样品的采集和检测试验设计成为研究的最大瓶颈。 目前, 在青海湖进行的禽流感疫情监测研究主要包括两个

28、途径，第一，直接捕 捉活体，分别通过棉拭子在喉头和泄殖腔取样进行病毒分离检测和血清取样进行抗 体水平检测10, 11；第二，间接捡取鸟类粪便，或提取环境中的污物和水体等，进行 病毒分离检测12-14。由于活体捕捉个体数量有限，并且量较少，没有一定的代表意 义；如果大量捕捉，又必然严重影响到鸟类的繁殖，甚至会导致其放弃繁殖地。活 体捕捉同时也与相关的制度和法律条例等相抵触，甚至还会引起国际动物保护组织 的非议15, 16。以美国为代表的取血清并环志的监测方法，导致鸟群可能因此发生应 激反应，从而偏离正常的迁徙路线17-19。从目前的监测研究现状来看，对青海湖鸟 岛斑头雁种群携带病毒现状或种群抗体

29、水平状况进行监测研究还需要建立更科学合 理的研究方法和思路。 引言 3 本研究基于子代特异性的母源抗体可以反映母体种群的病原体感染及免疫力获 得情况的基本原理，针对在青海湖鸟岛繁殖的斑头雁种群，设计了从其弃卵和巢卵 中提取母源抗体（maternal antibody, mab）进而对母体种群进行推测的实验方案， 以评估该种群对 h5n1 亚型 aiv 的免疫力等状况。由于在雏鸟出壳前一周的卵黄 mab 和出壳后一周内的雏鸟血清 mab 与亲鸟的母源抗体水平相似，本实验在人工 孵化后期进行卵黄取样的时间满足雏鸟出壳前一周内的要求。对卵黄母源抗体的检 测，采用定量血凝抑制试验，并以定性竞争性酶联免

30、疫吸附试验作校正。结果表明， 青海湖鸟岛斑头雁种群有一定比例（26.5%35.2%）的繁殖对具有对 h5n1 亚型 aiv 的免疫力。基于母源抗体的野生水鸟 h5n1 亚型 aiv 抗体检测方法可以用在野 生鸟类的禽流感监测和疾病防控中。 在青海湖鸟岛繁殖的斑头雁种群，在经历了 h5n1 亚型高致病性禽流感冲击之 后，存活下来的个体中有获得和未获得 h5n1 亚型 aiv 抗体两种情况。获得抗体的 个体可能携带或不携带病毒；而没有抗体的个体只有一种可能，即还没有接触到该 病毒，也就没有被感染。如果能够检测出青海湖鸟岛斑头雁种群子代的母源抗体水 平，而其又能够反映亲代是否传递 h5n1 亚型 a

31、iv 的抗体给雏鸟，由此可以得知该 种群是否具有 h5n1 亚型 aiv 抗体。因此本实验以检测子代对 h5n1 亚型 aiv 的 母源抗体评估青海湖鸟岛斑头雁种群对 h5n1 亚型 aiv 的感染及免疫力获得情况， 理论上具有一定的可行性，同时也是方法上的尝试。 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 4 第一部分 文献综述 第一章 野生鸟类 h5n1 禽流感监测的研究进展 1.1 高致病性禽流感在野生鸟类的暴发及影响 高致病性禽流感(hpai)在野生鸟类的暴发，促使野生鸟类在禽流感病毒传播中 出现了两个角色：由于迁徙鸟类引起的禽流感传播和野生鸟类贸易途径的禽流感传

32、播。在2005年发生的三个主要的hpai事件之后，野生鸟类被怀疑为在迁徙途中长距 离传播h5n1亚型高致病性禽流感的对象20, 21：首先，一个重要事件是2005年5月青 海湖h5n1亚型hpai的暴发。此事件中，整个青海湖保护区死亡鸟类总数达6253只 （12种），其中斑头雁（anser indicus）种群的死亡数量占死亡鸟类总数的一半以 上（3272只）22；紧接着青海湖事件之后，沿着中亚迁徙路线（图1-1绿色部分）， 2005年8月，在青海湖北部的蒙古共和国一个未发现家禽的地区（图1-1黄色星标的 大致位置），检测出斑头雁（anser indicus）和疣鼻天鹅（cygnus olor

33、）的h5n1亚 型aiv23；其次，在2005年10月，h5n1亚型高致病性禽流感病毒向西扩散至欧亚， 记录的有土耳其、罗马尼亚和乌克兰的暴发，通常在或接近迁徙鸟的越冬地，这一 长距离扩散途中没有任何病毒出现的记录；第三，2006年春季，h5n1亚型高致病 性禽流感病毒扩散至西欧，引发大量疣鼻天鹅（cygnus olor）和其他野生鸟类的感 染，尽管在这些区域有持续并加强的检疫，仍然没有在暴发之前检测到家禽的感染。 然而，2005年夏季h5n1亚型hpai在俄国和哈萨克斯坦的暴发是沿着连接中国西部 至俄国重要的贸易途径分布的，而不是沿着任何直接的迁徙路线7。 第一章 野生鸟类 h5n1 禽流感

34、监测的研究进展 5 图1-1 鸟类的亚洲迁徙路线 fig.1-1. asian migratory birds flyways23 从鸟类的迁徙习性研究来看，迁徙鸟类存在着传播禽流感病毒和引起禽流感流 行的地理差异的潜在可能性。大多数水鸟为了搜寻春夏季之间短暂的食物资源和躲 避严酷的气候条件，具有季节性迁徙习惯：它们春季迁徙到繁殖所需食物丰富的高 海拔北极区繁殖，繁殖后进行短暂的停留，立即带领幼鸟南迁以远离仲夏之后的霜 冻等寒冷天气。这样的迁徙习惯，导致了多种水鸟迁徙之前在繁殖地南部的集群24- 26。在秋季大部分鸟类南迁之前的繁殖地集群伴随着幼鸟成熟和成鸟换羽过程，这 种季节性的聚集中包括跟

35、随着成鸟并高密度聚集而免疫无能的幼鸟，直到生长一个 月并换羽之后才能飞翔，这种情形正促成了禽流感病毒的传播和重新分布20。禽流 感的病毒生态学研究表明，迁徙前水鸟的集群和高密度的免疫无能幼鸟，是引起禽 流感病毒流行的季节和地理上的差异，并导致在秋季迁徙之前不同种群繁殖聚集地 的流行高峰的两个因素20, 27-29。 近年来对h5n1禽流感的流行病学研究表明，鸟类在繁殖地和越冬地之间迁徙， 同时经过途中停歇地，迁徙过程中鸟类在三个地点都有携带禽流感病毒的可能。通 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 6 过对2006年分离出青海湖斑头雁的h5n1亚型aiv的病毒系谱分析

36、，得出06年的病毒 在系谱上和05年接近，且和斑头雁的迁徙路线上其他种类鸟的病毒核型相似。说明 2005年爆发的h5n1禽流感病毒一年后在青海湖的再次出现，此毒株更可能来源于 迁徙路线，而不是05年的毒株，即迁徙鸟将05年毒株的变种携带到青海湖；另一种 可能，是05年的病毒留在当地并发生突变。从2005年到2006年间欧洲和非洲h5n1 禽流感的暴发也是鸟类迁徙传播的结果（图1-2）。目前，高致病性的流感病毒已经 越过欧亚迁徙路线扩散，可能散播到其他迁徙路线11。而在秋季迁徙中，鸭科鸟类 a型禽流感病毒的流行率在繁殖地（北部）是在越冬地（南部）的三倍。在秋季迁 徙早期的高病毒流行率沿着迁徙路线

37、（南迁）而递减，因而a型禽流感病毒的流行 力有自北向南递减的趋势30, 31。 图1-2 20052006年野生鸟类携带病毒的潜在迁徙路线 fig.1-2. the potential routes of migratory birds from 2005 to 200611 第一章 野生鸟类 h5n1 禽流感监测的研究进展 7 实际上，野生鸟类与禽流感病毒之间是一种协同进化的关系，可以从携带禽流 感病毒而不发生感染的野生鸟类获得证据。野生水禽和涉禽是低致病性禽流感 (lpai)病毒天然的储存库，其中一些野生鸟类，如野鸭类(mallard ducks)和涉禽， 可以长距离携带和散播hpai（如

38、h5n1亚型）病毒，并不表现出任何临床症状，然 而另一些迁徙鸟类，如雁类(geese)、天鹅类(swans)和鹭类(herons)，通常会在感 染hpai病毒后死亡32-36。虽然高致病性禽流感病毒在野生鸟类种群感染并引起高比 例的死亡并不常见20, 27, 32，但是禽流感病毒在鸟类12个目（88种）中分离出来，报 道分离出最多，也是野生鸟类中携带禽流感病毒最多的是雁形目鸭科(anatidae, anseriformes)，如野鸭类、天鹅和雁类，鸻行目(charadriiformes)及鹳形目鸥科 （laridae, ciconiformes）鸟类28, 35。 1.2 对野生鸟类种群携带禽

39、流感等疫源性病原体的检测技术进展 对野生鸟类的禽流感病毒携带情况的评估，在整体免疫力评估的基础上进行抗 原和抗体的检测。野生鸟类种群免疫力检测技术可以通过一种免疫成分的检测反映 整体免疫力情况，而禽流感检测技术可以及时准确地检测到病原体和相应抗体的存 在与否。 1.2.1 野生鸟类种群免疫力检测技术进展 ken 和 matthew 等37将野生鸟类种群免疫力定义为一个宿主种群抵御或控制被 病原体或寄生虫感染的能力，总结出两类常被研究鸟类生活史策略的生态学家用来 评估免疫力的技术方法：常规监测技术（monitoring）和针对刺激原（challenge） 的检测评估技术。监测技术包括在每次取样时

40、对个体健康和免疫系统状态的测试， 结果除了提供个体免疫能力情况，还反映对当前感染的免疫系统的基础反应，例如 淋巴细胞数量低可能代表免疫力低下，也可能反映当前没有诱导宿主特异获得性免 疫反应的感染发生，相反，淋巴细胞数量高可能反映了高免疫力、当前感染状态或 者是两者的综合。 通过常规监测技术，无法预示鸟类在生活史策略和免疫能力间的投资权衡。因 而近年来生态学家用检测评估技术，在面临一种新的病原体（为对象种群的敏感原） 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 8 出现时，对免疫系统中的一个要素，通常为体液或细胞免疫在这一病原体暴露环境 中一系列的免疫反应的研究。检测评估的优

41、势在于，研究中的每一个体都通过对其 免疫系统的同一个标准来评估，即每一种免疫反应都以一个标准的方案检测。在此 统一标准评估之下，研究作为生活史决策成分之一的免疫能力，就可以避免研究中 个体差异的影响。 由于资源限制导致个体对其他免疫成分投资的降低，并且在免疫系统所面临重 要病原体挑战的选择压力之下，个体倾向于对一种免疫成分的投资，研究中可以将 对单一免疫成分的检测评估作为整体免疫能力的一个指数。对野生鸟类种群免疫力 的常规监测技术，包括白细胞计数（异嗜细胞和淋巴细胞） 、血涂片法测定异嗜细 胞和淋巴细胞比例（ratio of heterophil to lymphocyte，h:l） 、以血流

42、比容计测定血 沉层指数（白细胞丰富度测量） 、血浆蛋白（标准分光光度法）和血清蛋白（标准 琼脂糖凝胶电泳） ；检测评估技术方法，包括对异种抗原的特异抗体检测的 srbc(sheep red blood cell)血凝试验和细胞免疫反应的 pha（phytohemagglutinin） 皮肤肿胀测试37。 1.2.2 禽流感检测技术进展 禽流感检测方法研究进展分为病毒的分离培养、血清学检测、分子生物学检测 及基因芯片技术四个方向38。病毒分离培养检测周期长、操作复杂，不适用于快速 检测。常用的血清学检测方法有血凝和血凝抑制试验（hemagglutinin-hemagglutinin inhibi

43、tion, ha-hi） 、琼脂免疫扩散试验（agar gel immunodiffusion, agp） 、免疫荧 光技术（immunofluorescence assay，ifa）和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, elisa） 。分子生物学检测技术包括，反转录-聚合酶链式反应 （rt-pcr） 、荧光 rt-pcr、rt-pcr-elisa、依赖核酸序列的扩增技术 （nasba）以及环介导的等温扩增技术（lamp） 。基因芯片技术将 rt-pcr 获得 的 cdna 固化于芯片上，利用核酸探针技术构建检测 aiv 的芯片平台。 血清学

44、检测是利用抗原与抗体在体外和体内均能发生特异性结合的特性设计的 检测抗原或抗体的一系列免疫学检测技术，由于体外反应一般用含有抗体的血清进 行，所以又称为血清学技术。抗原和抗体发生结合反应的物质基础，是抗原的抗原 第一章 野生鸟类 h5n1 禽流感监测的研究进展 9 决定基与抗体的抗原结合部位之间的结构互补性，二者相互结合，在适宜条件下， 出现可见反应。抗原抗体反应具有特异性和可见性。特异性表现在一种抗原一般只 能与由它刺激所产生的抗体结合。当抗原抗体的数量比例恰当时，抗体分子和抗原 分子结合，相互交叉连接成网络状复合体，反应体系中基本无游离的抗原或抗体， 在适宜的盐浓度下，有明显的反应物（沉淀

45、物或凝集物）形成，肉眼可见。抗原抗 体反应可分为凝集反应、沉淀反应、采用标记物的抗原抗体反应等39。hi 试验属 于凝集反应，具有较高的特异性和敏感性，在试验前需要去除样本中的特异性凝集 因素，并对抗原进行标准化，目前 who 一般采用此方法进行全球流感病毒的监测。 agp 是沉淀反应中的单向免疫扩散反应，一般用来检测 aiv 的共同抗原核蛋白或 基质蛋白。ifa 和 elisa 是用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。ifa 是最早用 于鉴定和定位流感病毒感染细胞中的特异性抗原，主要是 np 或 mp 抗原，比病毒 分离鉴定更适用于禽流感暴发期间的快速诊断。elisa 具有较高的敏感性和特异性

46、， 操作简便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化，稳定性进一步提高。elisa 既 可检测抗体又可以检测抗原，尤其适用于大批样品的血清学检测。国内外大多采用 间接 elisa 和竞争 elisa 检测鸟类抗体水平40。 1.3 鸟类母源抗体及其应用 1.3.1 母源抗体 母源抗体（maternal antibody, mab） ，是免疫力低下的新生个体通过胎盘、初 乳、乳汁或卵黄从母体获得的抗体41, 42。哺乳类动物幼体通过胎盘或初乳获得母源 抗体，鸟类除鸠鸽科鸟类的鸽乳外，都是通过卵黄获得母源抗体。动物胚胎生活在 无菌的环境中，离开母体后立即进入富有微生物的外界环境中，新生动物自身产生 的

47、免疫应答都是潜伏期长、抗体水平低的初级应答，在外界环境中会由于无法抵抗 微生物而不易存活。因而由母体提供免疫援助，这种免疫援助是通过母源抗体提供 的。由于母源抗体的存在，新生个体对病原体入侵有较强的抵抗能力，例如仔猪和 羔羊对杆菌类的不感受性，就是获得了母源抗体的结果42。 刚孵出的幼鸟来自卵的无菌环境中，像哺乳类一样，需要暂时的免疫援助。产 卵之前，雌鸟就将其血清中的免疫球蛋白转移到卵黄中。卵黄免疫球蛋白 igy 通过 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 10 卵泡上皮主动转移到卵黄囊中43。有研究发现，在液态卵黄中的 igy 和母体血清中 的抗体水平相似44。在

48、卵沿着输卵管向下移动时，来自输卵管分泌物的 igm 和 iga 融合到卵白中。在雏鸡胚胎发育时，吸收卵黄中的 igy 到血液循环系统，而卵白中 的 igm 和 iga 混合到氨基酸液体中被胚胎吞食，因而出壳后的幼鸟在血清中含有 igy，而肠道中含有 igm 和 iga，前者待完成出壳后早期的免疫功能，后者已完成 胚胎在卵中发育的营养45。血清 igy 在出壳后一周内的雏鸡体内半衰期是 729hrs45。 1.3.2 母源抗体传递过程及机理 母源抗体传递，指由具有免疫能力的成体，尤其是雌体，通过胚胎传递或者初 乳、乳汁、卵黄等将其抗体传递给免疫能力低下的新生个体41。新生个体没有合成 内源性抗体

49、的能力, 因而来自母体的抗体将提供其后代生命早期体液免疫防御的最 初形式, 母源抗体大约从其后代开始主动合成抗体时消失46, 47。鸟类母源抗体传递 历程大致为三个阶段：在亲鸟产卵前的4-5天内，母源抗体开始大量传递到卵黄囊； 产卵后再发育的最后5-6天（即出壳前5-6天） ，大量母源抗体由卵黄囊传递到胚胎； 雏鸟在出壳5天后自身开始主动合成抗体，14天后开始分解母源抗体48。这样的传 递历程表明，雏鸟出壳前5-6天的卵黄母源抗体或出壳后5天内雏鸟的母源抗体水平 代表了母体的获得性免疫抗体水平，子代的母源抗体水平可以在一定程度上反应亲 鸟的特异性病原体感染及在其繁殖环境中的病原体状况8。 母源

50、抗体在子代的持续时间及降解速度由动物种类、免疫球蛋白类别、原始浓 度及半衰期的不同而有差异，其持续时间从鱼类的10天，到人体达到9个月不等 （见表1-1）41, 42。据研究，雏鸡出壳时大部分血清的igg均来自孵化过程中最后 56天的卵黄囊，出壳后14天后开始分解母源抗体，56周龄时开始独立合成抗体， 母源抗体水平接近成鸡水平24, 29, 31, 32。在仔鸽的母源抗体i型副粘病毒血清抗体与 母源抗体的比较研究中发现，仔鸽的母源抗体水平高低和维持时间长短和种鸽血清 抗体浓度直接相关：当种鸽血清抗体效价在6log2以下时，其所产仔鸽几乎不能得到 母源抗体(4log2以下)的免疫保护，而当种鸽血

51、清抗体效价在8log2以上时，其所产 仔鸽可全部得到母源抗体(4log2以上)保护49。 第一章 野生鸟类 h5n1 禽流感监测的研究进展 11 表1-1 mab在不同物种的传递途径 tab. 1-1 routes of transmission of mab across taxa41 种类出生前 mab 来源出生后 mab 传递途径 被动免疫 持续时间 主动免疫 发育时间 鱼类 鲤鱼 (cyprinus carpio) 卵黄卵黄10 天58 个月 爬行类 沙漠龟 (gopherus agassizii) 1 年 鸟类 家鸡 （gallus domesticus） 卵黄卵黄(5 天)2 周

52、6 周 6 个月 绿头鸭 (anas platyrhynchos) 卵黄卵黄2 周 71 天 金刚鹦鹉 (anas ararauna) 卵黄卵黄 6 周 哺乳类 褐家鼠 (rattus norvegicus) 胎盘肠道（20 天）4-10 周 2 周 小家鼠 (mus musculus) 胎盘肠道（20 天）6-10 周 2 周 豚鼠 (cavia porcellus) 卵黄4 个月 兔 (oryctolagus cuniculus) 卵黄12 个月 家马 (equus caballus) 肠道（24 小时）3239 天 人类 (homo sapiens) 胎盘肠道9 个月12 年 与哺乳类那

53、样能够终生产生新的抗原结合特性不同，鸟类只有在孵化期之前的 一段短暂的时间内由法氏囊产生的发育 b 细胞产生抗体结合的受体45，这是母源抗 体产生的基础。虽然已证实干细胞，b 细胞的前体，在进入孵化期之前就存在于胚 胎的骨髓中，但是 b 细胞在法氏囊中的克隆一般发生在胚胎发育的 8-14 天之间45, 50。法氏囊的发育还受到激素的控制，因而雄鸟会在表达第二性征和免疫能力之间 权衡，例如具有较大鸡冠的雄性家禽趋向于产生较少的抗体45, 51。 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 12 鸟类有三种免疫球蛋白，igm、igy 和 iga。不同于哺乳类的免疫球蛋白具有两

54、条轻链( 链和 链)，鸟类中有一条轻链( 链)。1969 年 leslie 和 clem 首次证实 52，鸟类的主要免疫球蛋白类型区别于哺乳类的 igg，为一种完全不同的蛋白，并 将其命名为 igy。鸟类的 igy 可能同时具有哺乳类 igg 和 ige 两种属性。尽管存在 鸟类患急性过敏性反应症状的事实，但没有遗传学或其他研究证据表明鸟类会产生 ige，而这种类过敏反应可能是由 igy 介导的45。鸟类通过产卵将母源抗体（母源 免疫球蛋白）通过卵中内容物传递给后代，其中卵黄含有 igy，而卵清中含有 iga。iga 是鸠鸽科鸟类通过鸽乳传递给后代的免疫球蛋白，这是鸟类母源抗体传递 免疫球蛋白

55、类型 igy 的一个著名的例外。雉鸡科鸟类都含有保守且完整的 igy，而 雁形目鸟类不但含有完整的 igy 分子，而且具有特殊的 igy 分子片段(fc)26-28。 拥有如 igy(fc)类小的抗体分子，有特殊的优势，例如小分子不会结合到巨噬细胞， 因而机体不会有激发致命超敏反应的潜在风险45。此外，雁形目鸭科鸟类的完整的 igy 分子和家鸡非常相似，有 25%的氨基酸完全同源，54%的氨基酸序列在恒定区 的半胱氨酸和色氨酸残基完全保守45。 尽管具有以上区别，抗体在所有物种的生物学角色都是抵御胞外入侵物，正因 为如此，抗体反应的基本机理和功能在不同脊椎动物类别中都是比较保守的。然而， 鸟类

56、表现防御功能的过程与哺乳类有一定区别，即使两者抗体分子在一定程度上相 似，b 细胞选择过程和多样性抗体产生的机制有显著不同45。鸟类 b 细胞选择过程 和哺乳类明显不同，可分为三个阶段24, 27, 28：首先，起源于干细胞的 b 细胞前体依 次在卵黄囊和骨髓中生长；然后，前提 b 细胞从骨髓迁移到法氏囊，在此经历阴阳 性选择；最后，只有在法氏囊中选择过程完成之后，成熟 b 细胞迁移到次级淋巴器 官，在此遇见外源微生物并产生抗体。抗体生成系统在鸭科鸟类的发育较晚。因而 在鸭科鸟类的卵中，孵化 16 天以后才能在法氏囊或脾脏中检测到 mrna 编码的 igm 的重链，23 天之后才能在颈淋巴结中

57、检测到，而骨髓、血沉层、哈氏腺和肝脏 中只有在孵化 7 天后才能检测出。对于 igy 的一种或两种同种异形分子，首次在鸭 科鸟类的卵中胚胎的颈淋巴结中检测到是在孵化的第 25 天，在脾脏和法氏囊检测 到是幼鸟孵化出壳一天后，在哈氏腺、骨髓和肝脏中检测到是在出壳后的 10-17 天， 血沉层中是出壳后的第 46 天检出45。 第一章 野生鸟类 h5n1 禽流感监测的研究进展 13 1.3.3 鸟类母源抗体传递与疾病防御 鸟类母源抗体传递与种群疾病防御的对应关系体现在间接遗传效应（indirect genetic effects, ige）和间接环境效应（indirect environmenta

58、l effect, iee）两种机 理41：首先，ige表现在以下三点，决定母源抗体传递的基因在亲代表达，而选择 作用则主要发生在子代接受母源抗体时，子代存活比起亲代更易受到这种传递变化 的影响；决定母源抗体传递的基因频率直到子代成熟并传递母源抗体给其下一代时 才有明显的变化；如果亲鸟选择升高体液免疫水平以传递母源抗体给后代将导致自 身细胞免疫和天然免疫的相应降低。其次，如果亲代暴露给特定的病原体并诱导产 生抗体后传递给其子代个体，再次受到同一病原体入侵时，子代个体会增高更有效 的母源抗体水平，称为iee或跨代表型可塑性53, 54。相反，亲鸟在传递前未曾暴露 给特定的病原体将不会传递这种病原

59、体诱导的抗体给雏鸟，使其子代易被感染55, 56。 在缺乏母源抗体时，后代的免疫反应会被抑制，若遇到严酷的病原体传播环境，存 活率必定降低57。尽管亲鸟产卵中抗体水平稳定，但同一繁殖对的雏鸟间的母源抗 体水平可能不同58, 59。 用来解释引起疾病暴发的典型机制的有以下三个因素60：第一， 暴露给病原 体的机会增多（如由于物种间新的接触） ；第二，病毒的突变；第三，宿主种群的 易感性增大（通过暴露给药物或污染） 。母源抗体可以改变病原体的表达，尤其是 其引发疾病的严重程度。在病毒传播率低时，大部分宿主种群在母源抗体缺乏的情 况下发生感染，从而发展到剧烈的疾病暴发；相反，在病毒传播率高时，大多数

60、宿 主带有母源抗体，感染后疾病的严重程度较小，并诱发免疫反应以保护宿主集体抵 御潜在的再次感染。因而，病毒传播率的降低改变了宿主和病毒的关系，使得大多 数疾病被母源抗体减弱，变为偶尔暴发但是剧烈的疾病61。 鸟类生活史策略选择中，是对生活史还是免疫力投资的权衡是限制免疫能力的 一个可控因素，其中有三个可以肯定的规律：鸟类的免疫能力一定收到资源的限制； 对生活史成分（如繁殖努力、性别修饰等）的投资与对免疫能力的投资之间成反向 相关，即在生活史投资越多，免疫能力越低，免疫能力与适合度之间呈正相关关系 37。 青海湖斑头雁 h5n1 亚型禽流感病毒母源抗体检测与免疫力评估 14 1.3.4 母源抗体