高效液相色谱HPLC培训教程（经典）

1、高效液相色谱hplc培训教程（经典）高效液相色谱hplc培训教程（经典）i概论一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用

2、大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，hplc)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(high pressure liquid chromatography，hplc)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(high speed liquid chromatography，hs

3、lp)。也称现代液相色谱。二、hplc的特点和优点hplc有以下特点：高压-压力可达150300kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。高速-流速为0.110.0 ml/min。高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。hplc与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合

4、物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(gc)和液相色谱法(lc)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。gc根据固定相不同又可分为气固色谱法(gsc)和气液色谱法(glc)，其中以glc应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。lc同样可分为液固色谱法(lsc)和液液色谱法(llc)。此外还有超临界流体色谱法(sfc)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用co2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法

5、(ac)、分配色谱法(dc)、离子交换色谱法(iec)、排阻色谱法(ec，又称分子筛、凝胶过滤(gfc)、凝胶渗透色谱法(gpc）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(pc)、薄层色谱法(tlc)、柱色谱法。四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510m。适用于分离分子量2001000的组分，大多数用于非离子型

6、化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如c18、c8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(n

7、pc)和反相色谱法(rpc)。 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如c18、c8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。rpc在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个hplc应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大

8、，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的ph值。但需要注意的是，c18和c8使用的ph值通常为2.57.5（28），太高的ph值会使硅胶溶解，太低的ph值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在ph 1.510范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法固定相极性 高中 中低流动相极性 低中 中高组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、

9、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的ph值和离子强度影响。ph值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它

10、是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用ods柱（即c18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/l的离子对试剂，在一定的ph值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其ph值、离子强度有关。5排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是

11、可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。ii基本概念和理论一、基本概念和术语1色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、

12、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。拖尾因子(tailing factor，t)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry fact

13、or)。中国药典规定t应为0.951.05。t0.95为前延峰，t1.05为拖尾峰。峰底-基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peak width，w)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。w4半峰宽（peak width at half-height，wh/2)-峰高一半处的峰宽。wh/22.355标准偏差（standard deviation，)-正态分布曲线x1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之

14、，大，峰形胖、柱效低。峰面积(peak area，a)-峰与峰底所包围的面积。2定性参数（保留值）死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相hplc中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(dead volume，v0)-由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。v0ft0（f为流速）保留时间(retention time，tr)

15、-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retention volume，vr)-从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。vrftr调整保留时间(adjusted retention time，tr)-扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tr只决定于组分的性质，因此，tr（或tr）可用于定性。trtrt0调整保留体积(adjusted retention volume，vr)-扣除死体积后的保留体积。3柱效参数理论塔板数(theoretical plate

16、 number，n)-用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。n取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。n与柱长成正比，柱越长，n越大。用n表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般hplc柱的n在1000以上。）若用调整保留时间(tr)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(n有效或neff)。理论塔板高度(t

17、heoretical plate height，h)-每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长l和理论塔板数计算。4相平衡参数分配系数(distribution coefficient，k)-在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，k有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(cs、cm很小)时，k只取决于组分的性质，而与

18、浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，k减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，k也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，k恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中k值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；k值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在hplc中，固定相确定后，k主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及ph值，以获得组分间的分配系数差异及适

19、宜的保留时间，达到分离的目的。容量因子(capacity factor，k)-化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（tr）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，tr0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。 容量因子与分配系数的不同点是：k取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积vs、vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与vs、vm有关。由于tr、t0较vs、vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。选

20、择性因子(selectivity factor，)-相邻两组分的分配系数或容量因子之比。又称为相对保留时间（美国药典）。 要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。5分离参数分离度(resolution，r)-相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。r。当w1w2时，r。当r1时，称为4分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。r1.5时，称为6分离，裸露峰面积为99.7%。r1.

21、5称为完全分离。 中国药典规定r应大于1.5。 提高分离度有三种途径：增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当1时，r0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及ph值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，r也趋于0；k2增大，r也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在110范围内，最好为25，窄径柱可更小些。二、塔板理论1塔

22、板理论的基本假设 塔板理论是martin和synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：1） 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。2） 样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。3） 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。4） 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。 虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板

23、理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。2色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积a） 由色谱流出曲线方程可知：当ttr时，浓度c有极大值。cmax就是色谱峰的峰高。因此：当实验条件一定时（即一定），峰高h与组分的量c0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。当进样量一定时，越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高hplc分析的灵敏度。 由流出曲线方程对v(0)求积分，即得出色谱峰面积a。可见a相当于组分进样量c0，因此是常用的定量参数。把cmaxh和wh/22.355代入上式，即得a1.064wh/2h，此为正常峰的峰面

24、积计算公式。三、速率理论（又称随机模型理论）1液相色谱速率方程 1956年荷兰学者van deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。 后来giddings和snyder等人在van deemter方程（后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即giddings方程）.2影响柱效的因素1）涡流扩散（eddy diffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展

25、宽。涡流扩散项a2dp，dp为填料直径，为填充不规则因子，填充越不均匀越大。hplc常用填料粒度一般为310m，最好35m，粒度分布rsd5%。但粒度太小难于填充均匀（大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，a0。2）分子扩散（molecular diffusion）。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项b/u2dm/u。u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。dm为分子在流动相中的扩

26、散系数，由于液相的dm很小，通常仅为气相的10-410-5，因此在hplc中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对dm进行校正。一般在0.60.7左右，毛细管柱的1。3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项cu又分为三项。 流动相传质阻抗hmcmd2pu/

27、dm，cm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。 静态流动相传质阻抗hsmcsmd2pu/dm，csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。 hm和hsm都与固定相的粒径平方d2p 成正比，与扩散系数dm成反比。因此应采用低粒度固定

28、相和低粘度流动相。高柱温可以增大dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。 固定相传质阻抗hscsd2fu/ds（液液分配色谱），cs为常数，df为固定液的液膜厚度，ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中hs与df的平方成正比，在吸附色谱中hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时hs可以忽略。 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：进样时间要短。填料粒度要小。改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。适当的流速。

29、以h对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，h最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.030.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。较小的检测器死体积。3柱外效应 速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即： 22柱内2柱外2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用零死体积接头连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积

30、应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应vr/。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积vr/2。 柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。由于hplc的特殊条件，当柱子本身效率越高（n越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典lc中则影响相对较小。第二章 高效液相色谱流程和设备图2-1高效液相色谱仪的流程示意图图2-1表示了一台典型高效液相色谱仪的流程示意图。泵吸入溶剂瓶中的流动相，经压力和流量测量，然后输出进入进样器。被分析样品由进样器注入，并随流动相一起依次通

31、过保护柱（非必须部件)、分离柱后进入检测器。检测信号用微处理机采集和进行数据处理，或用积分仪（或记录仪）记录色谱峰面积和色谱图。如果不是分析而是制备目的，可以使用馏分收集器。遇到复杂样品可以采用梯度淋洗操作（借助于梯度控制器），使样品各组分均得到最佳分离，且能花费更少的时间。整个仪器也可使用一台微处理机操纵，包括数据处理和操作控制。 需要特别指出的是，关于色谱仪的几个主要部件的性能问题，如泵的耐压性，流量的稳定性，检测器的灵敏度和整机的稳定性等，生产厂家一般都能给予足够的重视，但往往容易忽略“柱外效应”的影响。过大的柱外死体积会明显地损失柱效，从而导致总的分离能力下降，特别是当柱径减小到2mm

32、或更小时。下面简要介绍高效液相色谱设备中各部件的基本特点，以了解其概貌。至于各部分的细节将是以后各章讨论的主要内容。一、输液泵泵是一套高效液相色谱设备中重要的单元部件，是驱动溶剂和样品通过色谱分离柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。用于分析目的泵应当流量稳定(1)，耐高压(3060mpa)，能耐各种流动相，如有机溶剂、水和缓冲液。目前，高效液相色谱仪普遍采用体积小、方便多用的往复泵和隔膜泵。以往复泵为例，又有单、双和三泵头结构之分，显然，在单泵头的情况下，如果没有必要的补偿机构，脉动较大；若改为双泵头或三泵头，交替动作的柱塞分别以180和120的相位差排液和吸液

33、，则输出液流的脉动大为改善。因而后两种往复泵更受欢迎。对于分析极性范围宽或分子体积相差较大的复杂混合物，为了能在较短的时间内对所有各组分均实现满意的分离，常采用梯度淋洗操作。梯度洗脱又称溶剂程序，就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、ph值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置可分为以下两类：（1）低压梯度洗脱装置，又称外梯度。它是一种在常压下洗脱液按预先规定的比例混合后，再由高压泵输入色谱柱，所以也称泵前混合。（2）高压梯度又称为内梯度，它是将溶剂于高压泵加压后再混合的梯度洗脱装置。梯度洗脱

34、的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、ph值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。用于刚性微粒装填的高压泵多是气动泵和往复泵，主要恒量指标是能产生高压(40100 mp a)和较大的排液量(10至数10mlm i n)。这是自行装柱的实验室所必需设备。二、色谱柱 人们常说色谱柱是色谱仪的心脏，因为色谱的核心问题分离，是在这里进行的。在色谱发展史上，色谱柱填料与柱技术的发展一直是色谱工作者共同关心的问题，可

35、以说，液相色谱的每个重大发展都和色谱柱的每一次突破密切相关。为适应不同的分离分析要求，可有不同的柱型，内装不同性质的填料。最常使用的色谱柱是1030cm长，25mm内径的内壁抛光的不锈钢管柱，内装510m高效微粒固定相。采用高压匀浆装柱技术填充。相同柱长的效率远远高于气相色谱，以2mm细内径柱为例，250cm长的5微米ywg硅胶柱柱效可达20000理论塔板，而5微米yqgch反相键合相往往可达14000理论塔板，高效柱的填充需要特殊的设备和技术，国际上各色谱仪和色谱产品厂家均提供预装柱。三、进样器 被分析样品从柱头进样器引入的方式可分为注射器进样、停流进样、阀进样和自动进样器进样四种，其中注射

36、器和阀进样为最常用。在10mpa以下的进口压力可用110l的微量注射器进样，在这种情况下一般能获得最高的柱效率，但进样重复性不佳，特别是在较高压力下。阀进样是比较理想的，进样体积可变，也可以固定，但一般说来，柱效受些影响。自动进样器适合于多样品重复操作，便于用微处理机控制，实现自动化。四、检测器 被分析组分在柱流出液中浓度的变化可通过检测器转化为光学的或电学的信号而被检出，是色谱仪的“眼睛”。检测器性能的好坏直接关系着定性定量分析结果的可靠性和准确性。在高效液相色谱中最常用的检测器是光学检测器，例如示差折光、紫外吸收或分光光度检测器。前者是通用型的检测器，但灵敏度较低，适合于常量分析，后者中，

37、紫外吸收有比较高的灵敏度，但只能检出在仪器特定波长下有吸收的化合物。紫外可见分光光度检测器可适用较宽的范围，可以弥补单波长吸收检测器选择性太强的缺陷，因而是一种应用面较广的高效液相色谱检测器。近年来发展的二极管阵列紫外检测器允许对柱流出物进行不停流的瞬间的波长快速扫描，通过微处理机控制，获得光吸收、波长和时间的三维色谱光谱图，从而取得更多的定性和色谱峰纯度鉴定的信息，是一种比较理想的检测器。荧光检测器有较高的灵敏度，可比紫外吸收高101000倍，但也有更专一的选择性。对于一些电活性物质（如无机离子、有机酸、碱和两性离子），电化学检测器是一类较好的选择性检测器，例如对有机胺，安培型电化学检测器的

38、灵敏度可比紫外吸收高23个数量级。 但总的说来，高效液相色谱的检测器目前尚不理想，灵敏度不及气相色谱。发展更灵敏和更专一的检测器是今后应探索的一个重要课题。 色谱柱的恒温控制不象气相色谱仪那样每台必配，许多场合下色谱柱和检测器在环境温度下使用即能满足要求。必要时在较高温度下恒温操作，或者是为了增加柱效，改善分离，或者是为了取得更准确的热力学数据。大部分检测器也不一定精确恒温。受温度影响大的是示差折光检测器，因为折光指数随温度变化很大，温度不恒定，噪音和灵敏度显著受损，所以这种检测器必须恒温。紫外检测器经恒温控制后有利于增加稳定性。五、馏分收集器 如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是

39、为了做其他波谱鉴定，或获取少量试验样品的小型制备，馏分收集是必要的。用小试管收集，手工操作只适合于少数几个馏分，手续麻烦，易出差错。馏分收集器比较理想，因为便于用微处理机控制，按预先规定好的程序，或按时间、或按色谱峰的起落信号逐一收集或重复多次收集。六、数据获取和处理系统 把检测器的信号显示出来的数据系统可以有多种形式。最简单的是电位差式长图记录器，记录信号随时间的变化，得到色谱流出曲线或色谱图。而对定性定量较有利的是采用积分仪，记录保留时间或峰号，以及峰面积。先进的高效液相色谱仪多用微机控制，这通常是一台专用的微型计算机，其功能有二：一是作为数据处理机，例如输入定量校正因子，按预先选定的定量

40、方法（归一化、内标法和外标法等），将面积积分数据换算成实际的成分分析结果，或者给出某些色谱参数；二是作为控制机，控制整个仪器的运转，例如按预先编好的程序控制冲洗的选择、梯度淋洗、流速、柱温、检测波长、进样和数据处理。所有指令和数据通过键盘输入，结果在阴极射级管或绘图打印机上显示出来。更新一代的色谱仪，应当具有某些人工智能的特点，即能根据己有的规律自动选择操作条件，根据规律和已知的数据、信息，进行判断，给出定性定量结果。第三章 基本参数 高效液相色谱中，样品组分以一定量被流动相带入色谱柱内，在两相间多次反复平衡分配。利用分配中的微小差异而达到分离的目的。 为了描述分配过程和评价色谱柱效能。需要有

41、一系列的色谱参数和基础理论，从而找出最佳分离条件。一、基本参数（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱中保留程度的参数，并作为色谱定性的指标。其表示方法有保留时间、保留体积、调整保留时间和调整保留体积。1保留时间和保留体积 一般认为，当进样量很小时，样品从柱中流出呈高斯曲线分布。从进样开始到峰极大值所需时间称为保留时间，以tr表示，如图(3-1)所示。由于流出时间与流动相流速成反比，因此又可用保留体积作为保留值参数，以vr表示。vr=trfc (3-1)式中 ，tr为保留时间（分），fc为流动相流速（mlmin)。某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出所需流动相体积。不保留物质的流出时间

42、以t0表示，如图3-1所示又称死时间。而t0fc，即为系统内的死体积，简称死体积（v0）。死体积不仅与柱结构有关，而且与进样系统、检测系统有关只有当柱外体积忽略不计时，t0fc才表示柱内流动相所占的体积，以v0表示。任何色谱过程的基本保留方2分配系数任何色谱过程的基本保留方程式为： vr=v0+kvs (3-2)式中，k为平衡分配系数，vs为固定相体积，v0为柱内流动相所占体积（当柱外体积不容忽略时, v0表示柱内空隙及柱外体积之总和）。由式(3-2)可知，溶质的色谱保留行为主要是由该溶质在固定相和流动相中的平衡分配系数k所决定的，而k是溶质在两相间达到平衡分配时浓度的度量。其定义为，溶质在两

43、相间达到平衡时在固定相和流动相中的浓度比，即 （3-3）式中ms，vm，mm分别为溶质在固定相和流动相中的质量。3相对保留时间和相对保留体积扣除死时间或死体积的保留值，定义为相对保留时间(tr)和相对保留体积( vr)，如式(3-4)和(3-5)所示。tr = trt0 (3-4) vr = vr v0 (3-5) 保留值是色谱过程热力学的重要参数当色谱操作条件一定时，不同物质有其特定的保留值这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中，由于流动相参与了溶质分配过程，因此，样品组分的保留值不仅与固定相的性质有关，而且受流动相性质变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成对保留值的影响，是分离条件

44、最佳化的基础。4容量因子(k)容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数，它是样品组分的质量在两相中分配的比值，定义为 (3-6)tr =t0 (1 + k) （3-7） 可见，容量因子就是相对保留时间与死时间的比值。这可从色谱图上测得。在液相色谱中，只与固定相、流动相性质及柱温有关，而与流速和柱尺寸无关。5死体积(v0)和死时间(t0)的测定 在计算色谱参数中，常常用到t0或v0值。在液相色谱中的t0值不如气相色谱那样容易测定：这是因为，一方面液相色谱条件下不易找到一个在固定相上完全不保留的惰性物质，另一方面由于空间排斥作用，一些较大分子不能进入固定相微孔中，用在t0前流出，不易判断，下面介绍几

45、种常用的方法。 （1）采用比流动相溶剂分子少一个ch2，基因的同系物测定法，例如，当用己烷作流动相时，测定戊烷的保留时间作为t0值。 （2）在用混合溶剂作流动相时，以在检测器上有显著信号的纯溶剂作为测试死时间的样品。如在用甲醇-水为流动相时，用甲醇作测死时间的样品测其t0值。 （3）在硅胶色谱中，当用紫外检测器时，采用四氧乙烯作惰性溶质。反相色谱中亦有采用甲酸或硝酸等作惰性溶质，可近似地测定t0值。（4）计算法求t0。计算死时间时，准确性取决于柱内径的均匀性、柱填充程度及柱外死体积占总死积的比例。(二)分离因子() （3-8)代表了二个物质在相同的色谱条件下的分离选择性。物质的化学性质或结构上

46、的差异，反映在与固定相和流动相之间作用力也有所差异上。这就是色谱分离的基础。 改变是改变后一组分相对于前一组分的保留时间。的改变可以选择不同的固定相或流动相来实现。但改变固定相在液相色谱中比较麻烦。如在一个色谱系统中，用二根不同固定相的柱子，则又必须考虑到流动相的适应性。比较行之有效的办法是改变流动相的极性，如用连续改变流动相极性的梯度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择性。(三)洗脱剂线速度()，柱总孔隙度（t）和渗透性（ kf）1、洗脱剂线速度() 在色谱理论计算中，通常以流动相的平均线速度(cms)来代替体积流速。线速度通常由死时间和柱长(l)计算出。 (3-9)也可由体积流速和色谱柱的横

47、截面积(a)以及柱孔隙度(t)计算值 (3-10) 由(3-10)式可见，线速度和柱长l一定时，死时间tm一定，并且与柱内径无关。2、柱总孔隙度（t） 柱总孔隙度(t)是柱横截面上流动相占的分数，其大小主要取决于柱填料的类型。薄壳型填柱，流动相能占据的横截面大约为空柱截面的40。因此其t0.4。对于多孔硅胶或以硅胶为基质的填料，其t值在0.85左右。 由式(3-10)可求得柱总孔隙度。 (3-11) 式中各参数的单位，参见式（3-10），vc为空柱体积。3、渗透性（kf） 在液相色谱中，由于采用细粒度填料（310m）和粘度远比气体大的液体做流动相，所以通常情况下柱压降较大，因而对操作和设备提出

48、了更高的要求。 渗透性定义为 （3-12）式中，ko为渗透性常数（厘米2）；流动相粘度（帕秒，pas）；p为柱压降(帕，pa)；fc为洗脱剂流速(毫升秒)；l为柱长(厘米)；dc为柱内径(厘米)。 kr与fc、l成正比，与p成反比。在相同的和l时，达到所需流速的柱压越小，即/p越大，柱的渗透性越好。因此，在相同的实验条件下，/p可直接用作衡量柱渗透性的指标。另外，由上式也可知，要使柱渗透性好，就要用小的洗脱剂，柱渗透性好，分离时间也就短。 (3-13) 由于渗透性与填料的颗粒大小直接相关，因此又可用下式近似地计算kr值： （四）理论塔板数n和塔板高度h 理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相中

49、动力学特性的重要色谱参数，它是代表色谱柱分离效能的指标。理论塔板数的定义为n=5.54(tr/wh/2)2 (3-14)这是目前使用最广泛的计算n的公式。理论塔板高度的定义为 (3-15)考虑到样品流过柱内空隙体积时，并不与固定相发生相互作用，可采用扣除死体积的调整保留时间tr来计算塔板数或塔板高度，称为“有效塔板数（neff）”。 (3-16)上式中tm越接近tr neffn。同样。如果k；越大，tm的影响也越小 （3-17)（五）分离度r和k1及其影响因素 任何色谱过程的目的是要分离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要分离得好，一是色谱峰要窄，即wh/2值要小；二是两峰间的距离tr要大。前

50、者是如何选择最佳操作条件，提高柱效率的问题，即色谱动力学问题。后者是如何选择固定相、流动相，改善物质在两相间的分配(吸附)问题，即热力学问题。两者缺一都不能实现有效的分离。而不同“物质对”分离的好坏与难易，表现在分离度，又称总分离效能指标r或k1值的大小上。1、定义r为相邻两峰的保留时间之差与各自底峰宽一半之和的比值；k1值为相邻两峰保留时间之差与各自半高峰宽一半之和的比值。 (3-18)上式的分子（tr2-tr1）与固定相和流动相对样品组分的选择性(热分学特性)有关，而分母(二峰的平均底宽或二峰平均半高峰宽)则反映了色谱分离的动力学特性。二色谱峰的保留时间相差越大或峰越窄，则r或k1越大，分

51、离得越好。 若把色谱峰作为正态分布曲线，则k1与r的比值为一常数。从而说明，无论是用k1或r来度量峰分离度，实际上是一回事。 但是测量半高峰宽，显然比测量色谱峰的底线宽度来得容易与准确。对于未完全分离的峰更是如此。 由定义可知，当k11.0时可以出现两个峰。但是对于不等高的二物质峰，这个结论就未必正确了。当两峰等高。且r=1时，12（w1十w2）=4，二组分分离可达98；r=1.25,分离可达99.2%；而r=0.6时，则只有86分离开，两峰部分重叠(见图3-2)。分离度r与色谱分离中各主要参数k、n和有以下关系： 设w1= w2，r=（tr1- tr2）/ w2 又n=16（tr/w）2，代

52、入 因为 所以可得 因为 因而可得同理可得提高分离度可以通过改变k、n、三个参数来实现。增加k可以提高分离度，但当k 5以上，它对r的影响就越来越小，k增加就延长分离时间，色谱峰形变坦，影响检出灵敏度。因此，k改变的有效范围以1 k5为宜。 k的改变可以通过调节流动相的极性实现。对正相色谱来讲，流动相极性增加，k减小；反相色谱则相反，流动相极性增大，k增大。 增加n来提高分离度，就是使色谱峰变窄，从而将二个相邻的峰分开。越小，达到给定的r所需要的n越大，随着的减小，这种趋向越厉害。由此也可说明，适当增加（如用梯度淋洗），可降低所要求的n(减少柱长)，并可加快分离速度，如要求r=1. 0，从1.

53、01增加到1.10，则n从163000减少到1940。n的增加，一种办法是增加柱长，但这样分离时间便延长，柱压升高。而通过提高柱填料的色谱效能(如减小填料粒度)和装填的均匀致密来提高n则更为有效。这也是hplc与经典的液相柱色谱主要区别之处。综上所述，两峰分离的必要条件是：1、两组分在流动相及固定相间有不同的分配比，即k2/ k11；2、样品组分必须有一定的保留，即k (i)0；3、色谱柱对所分离的组分必须具有最低的必要的柱效率，即应有一定的理论塔板数n。液相柱填料选择液相柱填料选择液相柱填料选择 填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，其表面积越大，填充柱的柱效超高;然而粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3pm的填料应用。