碱性磷酸酶米氏常数的测定课件

1、碱性磷酸酶米氏常数的测定1 实验八实验八 碱性磷酸酶米氏常碱性磷酸酶米氏常 数的测定数的测定 碱性磷酸酶米氏常数的测定2 一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定的原理和方法，测出碱性磷酸 酶在以对硝基酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。 碱性磷酸酶米氏常数的测定3 二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1原理 碱性磷酸酶米氏常数的测定4 （二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T

2、为透光率；A为吸光率；I0为入射 光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光 程的厚度 碱性磷酸酶米氏常数的测定5 2常用方法 （1）标准曲线法 OD或 浓度 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 碱性磷酸酶米氏常数的测定6 （2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1mol/L时的 吸光系数，也称为摩尔吸光系数。 碱性磷酸酶米氏常数的测定7 (二)米氏常数的测定原理 酶促反应v-S曲线 v S 推导出米氏方程为： 其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数

3、SK SV v m m 碱性磷酸酶米氏常数的测定8 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏 方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/S作图，可得一条直线 m m m VSV K v 1 11 碱性磷酸酶米氏常数的测定9 1/v 1/Vm -1/Km 1/S 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP) 水解的Km和Vm. 反应式：pNPP+H2O p

4、NP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度 v。 碱性磷酸酶米氏常数的测定10 二、分光光度计的使用 碱性磷酸酶米氏常数的测定11 碱性磷酸酶米氏常数的测定12 仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测 试方式 透射比（T）、吸光度（A）、 已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜 率（F） “100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0 透射比)或0ABS(零吸光度) “0%”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长 碱性磷酸酶米氏常数的测定13 碱性磷酸酶米氏常数的测定14 3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器

5、预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波 长位置上 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T） 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖 盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“0%”键调透射 比零 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%”调100.0 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度（A） 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样 品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。 碱性磷酸酶米氏常数的测定15 三、操作方法 （一）对硝基苯酚标准曲线的制作

6、 取5支试管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm 以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD40

7、5nm值 为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系 数()值。 碱性磷酸酶米氏常数的测定16 (二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。 No. 1 2 3 4 5 底物终浓度S (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5 3 10mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6 蒸馏水（mL ） 0.5 0.45 0.4 0.3 0 0.1N 碳酸盐缓冲液（mL ） 各加1.0mL 20mmol/L MgCl2 （mL ） 各加0.2mL 预热 混匀，37，5分钟 酶液（mL ） 测定管各加0.2mL酶液 反应时间 37，精确

8、精确反应10分钟 0.1N NaOH（mL） 各加2mL 酶液（mL ） 空白管各补加0.2mL酶液 OD405 碱性磷酸酶米氏常数的测定17 （三） 数据处理 各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值 (OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm 相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各 种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表 示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求 出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度 Vm。 碱性磷酸酶米氏常数的测定18 四 注意事项 取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 测定OD405时要以各自的空白调零点。 移液管或取液器的使用 比色杯的使用 碱性磷酸酶米氏常数的测定19 返回 碱性磷酸酶米氏常数的测定20 管号1122 33 44 55 加酶 时间 （min） 0.5 m 1m1.5m 2m2.5m 3m3.5m 4m4.5m 5m 加 NaOH 时间 10.5 1111.51212