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文档简介

1、首先我们得来说说染料法 SYBR Green的原理，SYBR Green能够结合在双链DNA上面的荧光染料，只有结合了双链DNA，才会发荧光，而游离的不会发光。dsDNAr* J-r j-c l k f rr * 丄 i_ . i j-游离的SYBR Green不发尢但是，染料没有选择特异性，就是只要有双链 DNA，就会染上，并发荧光。 如果使用的引物产生了非特异性扩增，那么荧光强度就不是目的条带真实的强度, 因此会产生严重偏差。融解曲线我们如何判断本次qPCR扩增的都是目的片段呢？这就需要用到融解曲线。在qPCR循环反应结束之后，系统会进行测定融解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然

2、后每隔一定时间(1s或者少 于1s)测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBR Green 都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线：荧光强度(R)i708090温度(T)图2融解曲线然后我们运用医学中学到的 高等数学C的求导，把荧光强度对温度求导，得出下图荧光强度 变化值 (dR/dT)fJJL IX, I /7080 i90解链50%时的温度图3融解曲线的求导为什么中间的峰那么高？dR/dT越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升，达到图中Tm点时，大部分扩增出来的双链 DNA解开，荧光值下降非常快。如 果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在 80-90之间会形成一个单峰(温度和 qPCR产物长度以及GC含量相关)。但是除了单峰还会出现什么样的情况呢？ 请看下面两个示意图荧光强度变化值(dR/dT)菲肩出现在主峰前且温废一般低于80區跨是舲二呼，也可萤桂:异性扩壇出片段小于目的片段的产物A温度仃)图4前置杂峰荧光强度变化值(dR/dT)图5后置杂峰708070809

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