高效液相色谱法测定乳制品中的三聚氰胺

1、高效液相色谱法测定液态奶中三聚氰胺的含量1（华南师范大学化学与环境学院，广州 ） 2（华南师范大学化学与环境学院分析化学研究所，广州 ）摘 要 为建立液态奶中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法，通过超声提取，离心，有机滤膜净化，结合高效液相色谱进行样品测定。色谱柱：依利特 C18液相色谱柱（4.6150mm，5 m）。流动相：A液：离子对试剂缓冲液（0.9508g辛烷磺酸钠+1.0640g柠檬酸，配成1L溶液）；B液：甲醇；色谱条件：70%A+30%B。流速：1.0mL/min。柱温：40。波长：239 nm。进样量：2L。结果表明：三聚氰胺标准曲线为y=58093x+1060.1，相关系数R

2、2=0.9986，在0.01561.0mg/mL范围内线性关系良好。样品在三氯乙酸和乙腈（体积比=3：1）的提取条件下的加标回收率最高，为101.63%。关键词 高效液相色谱，三聚氰胺，液态奶1 引言1.1 三聚氰胺仪器检测方法概述 三聚氰胺(melamine)是一种重要的氮杂环有机化工原料1，俗称蜜胺。因其含氮量大于66%，且我国通常采用“凯氏定氮法”估测食品和饲料中的蛋白含量，三聚氰胺常被不法商人掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被称为“蛋白精”。但三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的。 国家质量监督检验检疫总局与国家标准化管理委员会联合发布

3、了原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法，即国标GB/T 22388-20082。这一新标准制定了高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）及气相色谱-质谱联用法（GC-MS）三种检测方法与标准。三聚氰胺的检测方法还包括酶联免疫吸附(ELISA)法等。1.1.1 高效液相色谱法（HPLC） 高效液相色谱法的定量限为2.0mg/kg，具有操作简单、灵敏度高，测定周期短等优点。其检测原理为：待检测样在离子对缓冲溶液的淋洗作用下在色谱柱流动，各成分在柱内经过吸附、溶解等过程实现分离。再利用相应检测器检测，最后通过相应标准物质出峰时间与出峰面积的比较，进行定性及定量分析。利用高效

4、液相色谱法测定三聚氰胺结果的精密度、重复性根据选择的检测条件如检测器、色谱柱等的不同而产生变化。试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。本方法的定量限为2.0mg/kg。在添加浓度2mg/kg10mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。1.1.2 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）液相色谱-质谱联用法定量限为0.01mg/kg，是一种利用液相色谱法分离与用质谱法定性相联用的分析方法。乳或乳制品中的三聚氰胺经过前处理操作提取、净化，在等体积乙酸铵和乙腈的淋洗作用下在色谱柱上实现分离，串联质谱检测，再通过

5、与标准物质色谱出峰时间、特征离子丰度比对照，最终实现定性、定量分析。该检测方法灵敏度高，较高效液相色谱法具有更强定性功能，且检出限更低。 试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。本方法的定量限为0.01mg/kg。在添加浓度0.01mg/kg0.5mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。1.1.3 气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS） 气相色谱-质谱法相较其他方法，灵敏度更高，其检出限为0.05mg/kg。检测原理是：原料乳或乳制品首先经过提取、净化，由于其分子质量较小，不容易被气化

6、，因此需使用硅烷化试剂进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式(SIM)或多反应监测质谱扫描模式(MRM)，用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比进行定性分析，外标法定量。此方法增加了衍生化过程，增加了前处理复杂度，且可能给分析结果带来了更多的不确定因素，因此更多研究人员优先选用高效液相色谱法测定三聚氰胺。 试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。本方法中，气相色谱-质谱法（GC-MS法）的定量限为0.05mg/kg，气相色谱-质谱/质谱法（

7、GC-MS/MS法）的定量限为0.005mg/kg。GC-MS法在添加浓度0.05mg/kg2mg/kg浓度范围内，回收率在70%110%之间，相对标准偏差小于10%；GC-MS/MS法在添加浓度0.005mg/kg1mg/kg浓度范围内，回收率在90%105%之间，相对标准偏差小于10%。1.1.4 酶联免疫吸附(ELISA)法 ELISA方法的原理是通过抗体、抗原相互结合，使加入底物显色从而来筛选样品是否含三聚氰胺残留，具有特异、快速、简单、稳定、易于自动化操作等特点，但该方法缺点在于，与分析样品相类似结构的物质亦可与特异性抗体发生反应，从而产生干扰。例如在三聚氰胺测定中，三聚氰酸与其结构

8、相似，容易产生特异性反应，从而使结果偏大。因此ELISA法一般只用于大批样品检测三聚氰胺残留量时的初步筛选，而对于超标样品的确证还需使用液质谱联用法或气质谱联用法。现今国内已有许多用于食品中三聚氰胺或三聚氰酸残留检测的ELISA试剂盒，且其检测灵敏度均达10-6以上5。Erica6使用三聚氰胺ELISA试剂盒分析宠物食品三聚氰胺的残留量，回收率为88%，方法检出限为9ng/mL。1.2 实验原理 高效液相色谱法的定量限为2.0mg/kg2，具有操作简单、灵敏度高，测定周期短等优点。其检测原理为：待检测样在离子对缓冲溶液的淋洗作用下在色谱柱流动，各成分在柱内经过吸附、溶解等过程实现分离。再利用相

9、应检测器检测，最后通过相应标准物质出峰时间与出峰面积的比较，进行定性及定量分析。利用高效液相色谱法测定三聚氰胺结果的精密度、重复性根据选择的检测条件如检测器、色谱柱等的不同而产生变化。 试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，其中包括超声提取、沉淀蛋白、过滤，得到测试液后，再经高效液相色谱测定。根据保留时间进行定性分析，试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2%3；采用多点校正外标法进行定量分析，待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线范围内。在添加浓度2mg/kg10mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间2。2 实验部分2.1 试剂与仪器2.1.1 试剂甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；辛烷磺酸钠

10、（色谱纯）；三聚氰胺标准品（CAS 108-78-01，纯度大于99.0%）；氨水（25%28%）；三氯乙酸；硫酸铅；乙酸锌；柠檬酸。除非另有说明，其余试剂均为分析纯，实验用水均为纯净水（怡宝饮用水）。甲醇水溶液（50%）：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀备用。三氯乙酸溶液（10g/L）：准确称取1.0g三氯乙酸，用水溶解后，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。乙酸锌溶液（10g/L）：准确称取1.0g乙酸锌，用水溶解后，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。硫酸铅饱和溶液：准确称取1.0g硫酸铅，用水溶解后，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。 离子对

11、试剂缓冲液：准确称取0.9508g辛烷磺酸钠和1.0640g柠檬酸，用约980mL水溶解，调节pH=3.0后，转移至1000mL塑料试剂瓶中，定容至刻度，混匀备用。 三聚氰胺标准储备液（2.5mg/mL）：准确称取0.2500g（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为2.5mg/mL的标准储备液，于4避光保存。2.1.2 仪器SHIMADZU SPD-M10A VP高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器；分析天平，感量为0.0001 g；低速离心机，转速不低于4000 r/min；数控超声波清洗器；具塞刻度试管，50mL；容量瓶

12、，25mL、100mL；烧杯，100mL、250mL；量筒，10mL、25mL；微量注射器，10L；一次性注射器，10mL；有机滤膜，0.45m；离心管；玻璃棒；胶头滴管。2.2 实验步骤2.2.1 样品处理参照GB/T 22388-2008标准的方法2 ，分别称取20mL试液（精确至0.1mL）两份于50mL具塞刻度试管中，其中一份加入0.1g（精确至0.1mg）的三聚氰胺标准品，另一份则不加；加入15mL10g/L三氯乙酸溶液和5mL乙腈。摇匀，超声提取10 min。静置2min，在离心机上以4000 r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶湿润的滤纸过滤后，取10mL滤液（精确至0.

13、1mL）于25mL容量瓶中，用三氯乙酸溶液定容至刻度，混匀。经0.45m有机滤膜过滤，上机测试。只改变提取剂中三氯乙酸和乙腈的加入比例，加入10mL10g/L三氯乙酸溶液和10mL乙腈。其他步骤不变，以同样的方法进行样品处理。只改变提取剂的组分，分别加入15mL10g/L乙酸锌溶液和5mL乙腈，15mL饱和硫酸铅溶液和5mL乙腈。其他步骤不变，以同样的方法进行样品处理。2.2.2 高效液相色谱测定 标准曲线的绘制。用三氯乙酸溶液将三聚氰胺标准储备液稀释得到一系列标准溶液，浓度分别为：0.0156 mg/mL、0.0312 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL、0.25

14、0 mg/mL、1.00 mg/mL，浓度由低到高进样检测，以峰高-浓度作图，得到标准曲线回归方程。 定量测定。待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。 结果计算。试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件处理得出，计算回收率。2.3 仪器工作参数色谱柱：依利特 C18液相色谱柱（4.6150mm，5 m）。流动相：A液：离子对试剂缓冲液（0.9508g辛烷磺酸钠+1.0640g柠檬酸，配成1L溶液）；B液：甲醇；色谱条件：70%A+30%B。流速：1.0mL/min。柱温：40。波长：239 nm。进样量：2L。3 结果与讨论3.1 三聚氰胺标准品色谱

15、图 在2.3色谱条件下，得到三聚氰胺标准样品的色谱图，如图1所示。走样时间20min，标准样品保留时间为9.7min左右，有较明显的拖尾现象。图1三聚氰胺标准品色谱图3.2 标准曲线与线性范围在选定的色谱条件下进样2L，以三聚氰胺质量浓度为横坐标，峰高度为纵坐标，绘制标准曲线，结果如表1、图2所示。回归方程为y=58093x+1060.1，相关系数R2=0.9986，说明分析物在0.01561.0mg/mL范围内线性关系良好。表1峰高与三聚氰胺质量浓度的线性关系浓度c(mg/mL)0.0156 0.0312 0.0625 0.1250 0.2501.00峰高121723004317917216

16、78258800图2峰高与三聚氰胺质量浓度的线性关系3.3 不同提取条件下测定样品（添加三聚氰胺标准品）的回收率 选择待测样品添加同一水平的标准品，分别按照4种不同的样品处理方法进行提取净化，测定三聚氰胺的质量浓度，计算回收率，结果见表2。从表2可以看出，4个样品的回收率分别为101.63%，85.97%，44.60%，90.64%。其中，由三氯乙酸和乙腈（体积比=3：1）组成的提取剂的回收率最高，为101.63%。分析可能原因如下：第一，蒙牛液态奶本身含有部分三聚氰胺。第二，先加提取剂，再加入三聚氰胺标准品，导致三聚氰胺直接与溶剂相溶而并未与液态奶混合，相当于将三聚氰胺全量从液态奶中提取出来

17、。第三，由于操作者本身的实验水平影响，进样量大于2L，使测试结果偏高。三氯乙酸、乙腈和铅离子都是沉淀蛋白的试剂，三氯乙酸能使蛋白质分子的肽链断裂，破坏蛋白质分子的结构使其沉淀。但对于大分子的蛋白质，其结构复杂性与致密性大，三氯乙酸可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，需使用乙腈这种有机溶剂抽提三氯乙酸而更好地沉淀蛋白，铅离子是重金属离子，使蛋白质变性成为固体沉淀下来，效果不如三氯乙酸好。因此，三氯乙酸+乙腈组成的提取剂是最好的选择，但其混合比例还有待进一步研究。表2 不同提取条件下测定样品（添加三聚氰胺标准品）的回收率（n = 1）样品提取剂（体积比）本底值/(mg/mL)加标量/(mg/mL

18、)保留时间/min测得值/(mg/mL)回收率/%1三氯乙酸：乙腈=3：1nd0.787210.3880.8000101.632乙酸锌：乙腈=3：1nd0.796810.3970.685085.973硫酸铅：乙腈=3：1nd0.796010.6990.355044.604三氯乙酸：乙腈=1：1nd0.803210.3410.728090.64 说明：nd表示未检出。3.4 样品检测结果将制备好的样品用所建立的样品处理和高效液相色谱方法测定，通过保留时间定性和外标法定量，结果如表3所示。由表3可知，样品不含有三聚氰胺，或者其所含量用该方法无法测定，说明市场上蒙牛液态奶质量保证可能较好。表3 样品检测结果（n=1）样品提取剂（体积比）保留时间/min测得值/(mg/mL)1三氯乙酸：乙腈=3：19.389nd10.347nd10.656nd10.947nd2乙酸锌：乙腈=3：19.786nd10.620nd10.835nd3硫酸铅：乙腈=3：19.393nd4三氯乙酸：乙腈=1：110.773nd 说明：nd表示未检出。References1 邵静群,温家琪,徐世文.三聚氰胺毒理学进展J.现代畜牧兽医,2007,12:52-54.2 国家质量监督检验检疫总局.GB/T 2238