解淀粉芽孢杆菌PEBA20生物膜表型特征及其与抑菌活性的关系汇总

1、山东农业大学硕士学位论文解淀粉芽抱杆菌peba20物膜表型特征及其与抑菌活性的关系姓名：范素素申请学位级别：硕士专业：森林保护指导教师：刘振宇2011-06-02山东农业大学硕士学位论文中文摘要植物病害生防细菌的研究是生物防治领域的研究热点，但是生防菌的应用却受到防 治效果不稳定、抑菌活性易下降甚至丧失的限制，这在很大程度上与人工培养条件改变 了其自然属性有关。同时也有越来越多的证据表明，在自然生境下，大多数微生物是以 生物膜(biofilm)形式而不是浮游形式存在，微生物生活史中的大部分是在生物膜的状 态下完成的。基于上述两点，本实验对一株杨树内生生防菌 bacillus amyloliqu

2、efaciens peba20进 行了生物膜表型特征的测定，并研究了与生防细菌抗菌活性的相关性。首先对peba20的野生型菌株 peba20-w0314的生物膜表型进行了系统阐述。 peba20-w0314在na固体平板上培养5d时，其生物膜表型为 鸟巢状”，向四周扩展 范围较小，向上隆起明显，为近圆形；peba20-w0314在nb液体培养基中静置培养48h 时，其生物膜表型为致密，坚固，完整，表面有波浪状纹理。对实验室规则人工继代过程中生物膜表型与抑菌活性的变化进行同步检测的结果 显示：整个过程约以第9代为分界，在第9代之前其生物膜表型及抑菌活性的变化较缓 慢，而在第9代之后生物膜表型和抑

3、菌活性均开始发生显著变化。截止至第 9代， peba20对玉米小斑病菌(bipolaris maydis)、苹果腐烂病菌(valsa mali)、杨树溃疡病菌 (botryosphaeria dothidea)和禾谷丝核菌(rizoctonia cerealis)的抑菌率仅依次下降了 9.1%、13.2%、5.4%和2.4% 。而其生物膜表型的变化也是从第 9代开始发生显著变化： 前期单菌落类型呈多样化，共先后出现 8类菌落类型，而后期单菌落类型逐渐减少，最 后只保留2种具有截然不同特性的单菌落；同时在气-液界面形成生物膜的厚度与坚固 性也呈逐渐下降趋势。表明野生型生防菌株w0314在实验室长

4、期继代保存时会发生生物膜表型与抑菌活性的同步变化，且两者变化规律存在相关性。对于peba20不同生物膜状态下发酵液抑菌活性的检测，同时进行了皿内实验和杨树愈伤组织上对杨树溃疡病 菌的抑制实验。比较了 w0314和nm0705的生物膜表型和抑菌活性，结果显示：与 w0314相比， nm0705的单菌落平坦，扩展面积较大，在气-液界面成膜较稀薄，坚固性差，生物膜半 定量法检测显示nm0705成膜菌的数量约为 w0314的1/2。同时nm705的抑菌活性相 对w0314其抑菌活性也显著下降，对四种指示病原真菌的菌丝生长抑制率分别下降了589.3%, 56.9%, 38.5%, 92.3%。对 nm0

5、705 进行 16srrna 和 tasa 基因的鉴定，测序结 果显示：nm0705的该两段序列与其野生株 w0314相比相似度为99%,为进一步利用 该菌株进行生物膜特性的研究奠定了基础，保证了菌株生物膜表型特征不同、但菌株种 类同一的准确性。关键词：解淀粉芽抱杆菌；生物膜；表型；抑菌活性；相关性abstractresearches on bacteria with bio-control acticity has become a hot topic about the biological control, but it s application was confined due to

6、 the unstable of the antibacterialactivity .this can be attributable to the difference environment between laboratory culture and natural conditions to a great degree. there are also increasing evidence demonstrate that, in natural habitats, most microbes exist as biofilm rather than as plankton. mo

7、st time of the microbial life is under the condition of biofilm.based on the above two points, this experiment is about the relationship between the biofilm phenotype and antibacterial activities of a single bacillus amyloliquefaciens bacterial strain peba20 which is isolated from poplar.at first, w

8、e elaborated the biofilm phenotype of peba20-w0314 systematically. when cultivated on na solid medium for 5 days, the biofilm phenotype of peba20-w0314 liked the “ bird s nest ” . they didn t expand to a large space, heaved skyward obviously and were sub-orbicular. when cultivated in nb liquid mediu

9、m for 2 days statically, the biofilm phenotype of peba20-w0314 was compact, strong, integrity and had wave-like pattern on the surface.the result of artificial subculture showed that the whole process could be separated by f9. the biofilm phenotype and antibacterial activity changed slowly during th

10、e early stage. but obvious changes appeared during the later stage. by the time of f9, the antibacterial activity of peba20 against bipolaris maydis 、valsa mali、botryosphaeria dothidea and rizoctonia cerealis descended 9.1% 13.2%、5.4% and 2.4% respectively. also, the change of biofilm phenotype beca

11、me obviously after f9. the diversity of single colonies was notable but this feature turned into inconspicuous during the later stage. there are 8 kinds of single colonies before f9, but developed into 2 kinds which had distinct feathers from each other. meanwhile, the thickness and sturdiness desce

12、nded gradually. the above results showed that the biofilm phenotype and antibacterial activity of the wild biocontrol bacteria w0314 changed synchronously during subculture in laboratory, the law of there change had relevance. the detections about antibacterial activity against b. dothidea of peba20

13、 with differentbiofilm phenotype was carried on both petri dish and poplar callus.we compared the biofilm phenotype and antibacterial activity of w0314 and nm0705. the results showed that, compared with w0314, nm0705 had smoother but larger single colonies. the biofilm formed on the liquid gas inter

14、face was thinner and fertilizer. half quantitative method detection showed that the amount of bacteria individuals of nm0705 was about the one half of w0314. meanwhile, the antibacterial activity of nm0705 also descended. the inhibition rates of hypha growth against the four plantpathogenicfungi dec

15、lined by 89.3%, 56.9%, 38.5% and 92.3% respectively. the result of nucleotide sequence analysis of 16srrna and tasa from nm0705 which root in our laboratory by repeatedly subculture shows that the sequence similarity between w0314 and nm0705 is 99%. the above results formed the foundation for more r

16、each on biofilm feature by peba20. the result also given evidence about same strain presented different biofilm phenotype.key words: bacillus amyloliquefaciens ; biofilm; phenotype; antibacterial activity; correlation英文缩略词及中文对照表英文缩写英文全称中文名称edtasdstemed trispcr x-galiptgrnaseebamp oddntp te min sec m

17、ln l0c6-ba2,4-dethylene diamine tetraacetic acid sodium dodecyl sulfate tetramethyl ethylene diamine tris droxymethy aminomethane polymerase chain reaction5-bromo-4-chloro-3-indolyl- &d- galactosideisopropylthio- &d-galactoside ribounclease ethidium bromide ampicillinoptical densitydeoxyribonucleosi

18、de triphoshatetris/edta bufferminutesecondmicrolitermillilitercentigrade6-benzylaminopurine2,4-dichlorophenoxy已二胺四乙酸十二烷基硫酸钠四甲基乙二胺二羟甲基氨基甲烷 聚合酶链反应5-澳-4-氯-3引珠-b -d-半乳糖 甘异丙基硫代-b-d-半乳糖甘核糖核酸酶澳化乙锭氨卞青毒素光密度脱氧核甘三磷酸tris/edta缓冲液分钟秒毫升微升摄氏度6-基喋吟2, 4-二氯苯氧乙酸酯i关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得 的成果。对在论文

19、研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体, 均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学 校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文 收录到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：日期：山东农业大学硕士学位论文1 .弓i言越来越多的证据表明，在自

20、然条件下，大多数微生物是以生物膜( biofilm)形式存 在，而不是以浮游状态存在，微生物生活史中的大部分是在生物膜的状态下完成的。1.1 细菌生物膜研究概况1.1.1 细菌生物膜的概念在自然生境下，大多数微生物是以生物膜(biofilm)形式存在，而不是以浮游状态 存在，微生物生活史中的大部分是在生物膜的状态下完成的。细菌生物膜是菌体附着到生物或者非生物物体表面后分泌粘性胞外聚合物并在其 中生长繁殖而形成的细菌群落，是一个连续、组成成分复杂、具有三维结构和信息传递 系统的复杂的细菌群体(shapiro 1998; costerton et al. 1999; ram et al. 2005

21、; stewart and franklin 2008)。1.1.2 细菌生物膜的形成动态现在已经知道，与浮游状态的细菌相比，生物膜状态下细菌启动一套完全不同的基 因系统，二者的生理状态显著不同。生物膜多细胞结构的形成是一个动态过程，包括细 菌起始粘附、生物膜粘附期(attachment)生长期(development)、成熟期(maturation)和 播散期(detachment污阶段。细菌感受环境信号激发生活方式发生改变开始形成生物膜 (fletcher 1976; stanley 1983; wang et al. 1996; palmer and white 1997; wimpen

22、ny and cofasanti 1997; otoole and kolter 1998; pratt and kolter 1998; stoodley et al. 1999; watnick and kolte 1999; otoole et al. 2000)。对宿主表面的粘附是细菌在宿主体内形成 生物膜的第一步。这种粘附作用主要是细菌表面特定的粘附素蛋白识别宿主表面受体的 结果，因此具有选择性和特异性。宿主组织表面的蛋白、糖蛋白和糖脂常可作为受体， 而选择性地吸附特定种类的细菌。palmer和white概述生物膜形成的早期阶段包括细胞 与表面及细胞与细胞之间的相互作用，而后才发展成

23、为成熟的生物膜(palmer and white1997)。前人研究认为，简单的化学模型可以解释菌体初始粘附阶段的行为(palmer andwhite 1997)。尽管这些相互作用对细胞与表面之间的互作做出了贡献，然而这些过程是 比较复杂的。例如，可能许多参与粘附过程的生物膜细菌在各阶段则具有不同的生理生 化特性，有不同的基因表达与调控，基因在各阶段起到不同的作用 (kobayashi 2007; monds and otoole 2009)。形成生物膜对细菌有诸多益处，最重要的是抵御不良环境的 侵害(davey and otoole 2000)。1.1.3 细菌生物膜的特征生物膜在最近十年成

24、为了微生物研究的一个热点领域，因为形成这一结构后，聚集 成团的群体细胞能够具有类似多细胞组织的功能及特性(shapiro 199$ ,同时，生物膜实际上是一个微小生境，该生境与周围环境可能有着明显的区别，从而使其中的细胞 展现出区别于游离细胞的特性 (davey and o toole 2000目前已经发现生物膜是微生 物在自然界中的主要存在形式。和浮游细胞的表型特征明显不同的是细菌生物膜具备三维结构。胞外聚合物是生物膜的标志性特征，其主要成分是胞外聚多糖(exopolysaccharide、tasa蛋白和dna。 由15个连续的基因组成 epsa-o操纵子负责胞外聚多糖的形成，分泌蛋白tas

25、a由yqxm-sipw-tasa操纵子控制合成(branda et al. 2006; vlamakis et al. 2008)。胞外聚合物 不仅是细菌生物膜的结构组分和胞外基质的骨架，而且参与了细菌结构形成、侵染、对 外界刺激应答反应等很多重要生物学功能。1.1.4 调控生物膜形成的相关基因生物膜的形成是一个复杂过程，涉及多个基因、多个细胞因子，以及微生态环境中 细菌之间的相互作用。近年来，采用 dna微矩阵、突变体等研究手段，对一些医学致 病菌，包括 escherichia coli, pseudomonas aeruginosa vibrio cholerae, streptococc

26、ussp., staphylococcussp., candida sp.等的生物膜形成的分子机制开展了大量研究，不少种类 细菌已经揭示出生物膜形成相关基因及其调控回路的基本框架(lazazzera 2005; stewartand franklin 2008)。枯草芽抱杆菌(b. subtilis)是重要的生防因子，也是一种模式细菌。基于 b. subtilis 168菌株生物膜形成的调控机制的基础上，科学家目前发现 b. subtilis生物膜形成过程 存在6个基因调节子，即 abrb、spo0a、立ccpa、degu和sinr。其中spo0a, sigh和degu是正调控因子，而abrb

27、, ccpa和sinr为负调控因子。spo0a调节细菌稳定期的生物行为，包括生物膜形成、芽抱形成等，其调控的基因 表达具有剂量的依赖性(fujita et al. 2005)。abrb阻遏spo0a基因的活化，而 spo0a则 抑制abrb的基因转录，spo0a调控生物膜形成的功能受到 abrb转录的抑制。另外， abrb抑制了 yqxm-sipw-tasa操纵子的转录，而tasa是细菌生物膜胞外聚合物的主要 蛋白成分(branda 2006; verhammeet al. 2009)。degu是控制细菌生物膜形成的关键基因，一个正调控因子，目前，degu的调控靶标已经被鉴定，包括 poly-

28、t-glutamic acid、yuab 和 yvca 等(stanley and lazazzera 2005; murray et al. 2009)。在细菌的双组分 degs-degu信号转导系统中，degs是膜相关组 氨酸激酶(membrane-associatedhistidine kinase)感受外界信号，degu是细胞质响应调 节子(cytoplasmic response regulator) degu经磷酸化作用后，调控一系列的基因转录来 调控细胞反应，包括运动性、簇集性、胞外蛋白酶分泌，以及生物膜的胞外聚合物的合 成、菌膜和菌落复杂结构的形成等，degu的突变体不能形成完

29、整的生物膜(stanley and lazazzera 2005; brandaet al. 2006; kobayashi 2007; verhamme et al. 2007; verhamme et al. 2009)。然而，关于degu中生物膜形成中的作用并没有完全清晰。sinr是一个负调控子，对yqxm-sipw-tasa操纵子和epsa-o操纵子起着直接的负调 控作用,sinr的缺失会形成多皱的生物膜 (kearns et al. 2005; chu et al. 2006)。而sinr 介导的阻遏作用受到sini转录调控。sini是一种小肽，它通过结合到sinr上而抑制sinr

30、的蛋白活性。sinr还是某些鞭毛基因转录的正调控因子，因此，人们推论sini/r系统是支配细菌从浮游态转变成为生物膜状态的主要调控系统(kobayashi 2008)。但是，它们在生物膜形成过程中的精确作用尚需要进一步研究。细菌从浮游状态转变成为生物膜形式经历了一个非常深刻的变化，其基因的表达具有不同于浮游态细菌的独特格局(vilainand brzel 2006; verhammeet al. 2009)。关于枯草芽抱杆菌的生物膜相关基因的调控网络如图1所示(jared 2009。51ex* pperon叫口$ opnron4 * . r.事:，-rerna / 工remb:f tasa j

31、 fps *酊时im图1枯草芽抱杆菌生物膜形成相关基因调控网络fig 1 model of b. subtilis biofilm matrix operon regulation.1.1.5 群体感应机制从浮游状态到细菌生物膜，细菌经历了从低密度到高密度、从无组织状态到有组织状 态的过程。在细菌完成了表面附着后，细菌群体感应机制就在生物膜的形成中发挥重要的 作用。群体感应(quorum sensing)是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种生 理行为，具有群体感应的细菌能产生并释放称为自体诱导物(autoinducer)的信号分子,它随着细胞密度的增加而增加，当积累到一定阈值时可与调控

32、蛋白结合从而启动细菌中 特定基因的表达。细菌细胞通过群体感应信号分子与周围环境进行信息交流，从而改变 其生理活性，如共生、细菌毒性、运动性、抱子及生物膜的形成等。现在发现许多细菌 利用该系统调控体内特定的功能，如根瘤菌与植物共生(wisniewski and downie 2002), 蓝细菌中异形胞的分化(yoon and goldenj 1998),芽胞杆菌中感受态与芽胞的形成 (lazazzera 2001)病原细菌胞外酶与毒素产生(von 2003),次生代谢物hcn、胞外蛋白 酶、几丁质酶、抗生素形成等(pierson 1994; pierson 1996; wood 1997; l

33、eonid 1998;whistler 2003)功能都受到细菌群体感应信号系统所调节，其中多种功能具有生防作用。1.1.6 细菌生物膜研究现状近十年来，在医学上，生物膜状态下的细菌因为具有更强的毒力、耐药性和对抗宿 主免疫防御的能力而备受关注；在工业上，也因为细菌生物膜的食品污染、管道腐蚀等， 引起人们重视；在农业上，人们逐渐认识到病原细菌的侵染与生物膜关系密切。作为致 病因子和环境损害因素，细菌生物膜起着关键和特殊作用的事实已经被科学家所公认， 激发人们对细菌生物膜的关注达到了前所未有的高度并仍有上升趋势(danhorn andfuqua 2007; stewart and frankli

34、n 2008; vlamakiset al. 2008; monds and otoole 2009。但 是现在关于细菌生物膜的研究主要集中于医学领域，对于植物相关细菌尤其是植物病害 生防菌生物膜的研究甚少。1.2 生防菌的生物膜形成与抗菌活性的关系目前对于生防菌的研究主要集中在杆菌中，在首先被用于防治害虫和病原物的生防 因子中就有杆菌属的成员(powell and jutsum 1993; bais and vivanco 2004。1.2.1 生防菌中芽抱杆菌的研究现状美国迄今已有4株枯草芽抱杆菌生防菌株获得环保局(epa)商品化或有限商品化生 产应用许可，它们是gb03,mbi600 ,

35、 qst713和解淀粉枯草芽抱杆菌变种(b. subtilis var.amyloliquefaciens fzb24)。gb03 0品名为 kodiak)和 mbi600 (商品名为 subtilex)分 别由美国gustafson公司和microbio ltd 公司开发，根部施用或拌种可防治镰刀菌属 (fusarium)、曲霉属(aspergillus)、链格抱属(alternaria)和丝核菌属(rhizoctonia)引 起的豆类、麦类、棉花和花生的根部病害。2001年gustafson又将解淀粉枯草芽抱杆菌和枯草芽抱杆菌混合制成混合生防药剂，称为 bioyield。taensa公司生

36、产的fzb24,作 为植物促长剂被商品化生产，商品名 taegrotm,施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装 饰植物根部可防治镰刀菌和丝核菌引起的枯萎病和根腐病。止匕外，澳大利亚开发的 b. subtilis a-13对麦类和胡萝卜立枯病以及其他土传病害具有很好的防治和增产作用 (baker 1987)。日本东京技术研究所的 b. subtilis rb 14 和 b. subtilis nb22 分别对 r. solani, f. oxysporum和p. solancearum,引起的番茄病害有良好的防效 (asaka 1996)。中国利用芽抱杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，

37、现已开发成功并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等。江苏省农业科学院陈志谊等 人研究获得了对多种病原菌有强烈抑制作用、防治水稻纹枯病的效果达50%81%的b.subtilis b-916菌株(陈志谊等，2003 )。谢栋等(1998)分离到枯草芽抱杆菌 (b. subtilis) bs-98能强烈抑制苹果轮纹病菌(p. piricola)等植物病原真菌的拮抗菌。范青等 (2000) 从北京苹果园土壤中分离的枯草芽抱杆菌b-912防治柑桔青霉病、绿霉病均取得较好的抑制效果。林东等(2001)发现枯草芽抱杆菌(b. subtilis ) s0113对水稻白叶枯病菌(xanthomona

38、s oryzaepv.oryza8具有强烈的抑菌作用。何红等(2002)发现来自辣椒体 内的枯草芽抱杆菌(b. subtilis) bs-1和bs-2菌株对香蕉炭疽病菌菌丝生长、 分生抱子形 成及萌发等有较强的抑制作用。目前，芽抱杆菌作为生防菌仍存在许多问题。大多数芽抱杆菌的生防研究总体上还 处于实验室阶段。在生产应用时，由于易受土壤温湿度、ph值、作物生长状况及土壤中生态系统等微环境因素的影响，防效不稳，因此，影响了芽抱杆菌的大面积推广应用。1.2.2 芽抱杆菌生物膜形成与芽抱形成的关系长久以来，人们将芽抱形成作为区别细菌的依据，但是在单个细胞的研究中，它也 具有重要意义(masaaki 2

39、006)。一个控制抱子形成的后期阶段的基因，sspe ,被证实 在枯草芽抱杆菌生物膜中空结构的末端显著表达(branda 2001另外，dna结合蛋白 spo0a是细胞从营养生长期进入芽抱形成时期的关键应答调节(master response regulator)蛋白，细胞是否开始形成芽抱最终由内外环境条件来决定，内外界环境是否 适宜开始形成芽抱最终反映为 spo0a的含量和磷酸化水平。只有当spo0a的含量和磷 酸化水平达到一定阈值，芽抱才开始形成。影响芽抱形成的外界因素主要是细胞密度和 营养状态(hibert and piggot 2004)。而spo0a基因在枯草芽抱杆菌中已被证实是调控

40、 生物膜形成的关键基因，并与枯草芽抱杆菌6051中表面活性素的分泌有关(bais et al.2004; schweitzer 2008)。在芽抱形成过程中，spo0asfp, yveq口 yver, spo0h,是四个关键基因，spo0a抑制 abrb的表达，它结合abrb的启动子(hamon and lazazzera 2001)而sigma-h可能直接 抑制abrb的表达，刺激生物膜的形成，因为已知 sigma-h可以激活spo0a (predich et al. 1992)。进一步试验表明，编码一个碱性蛋白酶的基因apre和一个二肽酶的基因dppa/b/c/d/e均受abrb的调控，而

41、胞外蛋白酶活性，包括apre和npre,已被证明对菌体 聚集和生物膜的形成是必需的(connelly et al. 2004)。1.2.3 芽抱杆菌生物膜形成及抗菌活性物质的产生在植物根围，枯草芽抱杆菌可以促进植物生长并起到生物防治的作用(emmert andhandelsman 1999)。最近的研究表明生物膜模式对细菌作为生物防治因素起着至关重要 的作用(bais and vivanco 2004)。这种抗菌作用的机制还不明确，但是我们已经知道枯 草芽抱杆菌可以产生多种抗菌因子。其中包括多种脂肽类化合物，比如枯草菌脂肽就是 一种重要的表面活性素，它对维持生物膜的中空结构也用重要作用(bra

42、nda 2001)。bais等人曾经报道枯草芽抱杆菌 6051对丁香假单胞菌的生防作用与根系表面枯草菌脂肽的 形成有关(bais and vivanco 2004综合现有的资料，枯草芽抱杆菌 6051生物膜中产生 的枯草脂肽可以用来防止浮游细胞及其他微生物在植物根系等生物表面定殖。masaaki认为，在根部定植时，枯草芽抱杆菌6051形成稳定的大规模的生物膜，并且分泌枯草脂肽，这两种因素均对致病细菌对植物的侵染起抵抗作用(masaaki 2006)。bais等人发现作为革兰氏阳性生防细菌的 b. subtilis能够在植物根际形成强大的生物膜而抑制其它 微生物的定殖与侵入，同样革兰氏阴性生防细

43、菌pseudomonas fluorescen也具有这种特性(bais et al. 2004; ongenaet al. 2005; danhorn and fuqua 2007; schweitzeet al. 2008)。 bais等(2004)和schweitzer等(2008)证实，b. subtilis 6051能够在植物根际以生物 膜形式定殖，并分泌具有杀菌作用的表面活性肽surfactin, surfactin与细菌生物膜的形成有关，它由由磷酸泛酰琉基乙胺基转移酶(pptase)的编码基因sfp控制，而sfp由细菌生物膜形成的关键调控子 spo0a所调控。1.3 生防细菌生物膜

44、表型与其抗菌活性的关系目前尚没有直接证据表明生防细菌生物膜的形成与其抗菌活性具有相关性。但是， 人体、动物、植物致病菌生物膜的研究证实，生物膜状态下的细菌比浮游状态下细菌具 有更强大的毒力和致病性，毒力因子的产生与细菌生物膜的形成具有相关性(danhornand fuqua 2007; stewart and franklin 2008; monds and otoole 2009 因此理论上，可以 形成假设：生防菌生物膜形成与拮抗活性有相关性。而近来的研究也证实了这个假设。众所周知，在实验室内，很多微生物分离物在持续摇瓶培养的情况下，会停止产生 抗菌化合物，并且有研究发现野生型枯草芽抱杆菌形

45、成的生物膜比多次次培养之后的实 验室菌株强壮，而且它依赖于胞外抗菌脂肽表面活性素的产生。其主要原因应该归咎于 人工培养条件很大不同于自然环境(natural environment)。科学家发现，设置培养条件， 将菌株在形成生物膜的状态下培养，b. subtilis和b. pumilus能够产生在浮游状态下所不 能产生的一些复杂的抗菌化合物，能够恢复在浮游状态下不断培养而丧失的产生抗生素 的能力(yan et al. 2003; bruhn et al. 2007)。生防菌株在生产上的实际应用效果往往不够稳定，其根本原因尚在于生防菌所释放 环境的复杂性，影响了生防菌的定殖、生长、发育，以及活性

46、物质的产生、释放和作用， 而诸多证据表明，生物膜状态下的细菌更有利于其生防能力的发挥，因此，可以通过模 拟其自然状态的生物膜格局，使生防菌形成有益的抗生素类次生代谢产物，更有利于其 定殖并发挥抗病作用。1.4 本研究的目的意义植物内生生防菌，因为其具有特殊的生活生境、更稳定和持久的作用效果、产生特 殊活性代谢产物等特征，已经成为国内外生物防治研究的热点( chao et al. 2007; conn et al. 2008)。生物膜是细菌更适应于自然界中的一个决定性策略。长期以来，科学家仅 对浮游细菌进行研究，却忽视了细菌生物膜研究。因此，在生物膜框架下开展研究，必 将促进人们对细菌更深刻的了

47、解，甚至得到前所未见的信息。解淀粉芽抱杆菌是否也具有生物膜现象。目前尚未见相关研究报道。从生物膜角度 入手，探讨生物膜状态下解淀粉芽抱杆菌 peba20的特征，也许能够获得研究浮游状态 下细菌所未显现的原本的自然属性， 而这些自然属性，对了解peba20的生防活性存在 重要意义。本实验室已经较系统地研究了杨树内生细菌的内生生态特征，发现和筛选得到了具有良好生防潜力的菌株，并测定了杨树内生解淀粉芽抱杆菌 peba20的分类学、生物学、 生理学等特性，测定了其活体和发酵液对杨树溃疡病的作用效果，证实该菌株是具有很 大应用潜力的杨树内生生防细菌。本研究就是着眼于作为一种对杨树溃疡病具有良好生防潜力的

48、内生细菌，解淀粉芽抱杆菌peba20的生物膜与其抗菌活性的相关性，这对利用生物膜发挥其在植物病害防 治中的作用具有重要意义。2.材料与方法2.1 供试材料2.1.1 菌株2.1.1.1 生防细菌本研究中所用生防菌株 peba20为本实验室分离的一株对多种植物病原细菌和真 菌具有良好抑菌效果的杨树内生解淀粉芽抱杆菌(bacillus amyloliquefaciens),将其野生型菌株命名为peba20-w0314,另外一株经实验室不规则继代保存后产生的生物膜表型 自然突变株命名为peba20-nm0705。2.1.1.2 指示植物病原菌供试真菌菌种：杨树水泡溃疡病菌(b. dothidea)、

49、禾谷丝核菌(r. cerealis)、苹 果腐烂病菌(v. mali)均为本实验室保存。供试细菌菌种：白菜软腐病菌(erwinia carotovora )、烟草青枯病菌 (ralstoniasolanacearum)、马铃薯环腐病菌 (clavibacter sepedonicum)均为本实验室保存。2.1.21口刁下百号nb培养基：牛肉浸膏 3.0g、蛋白陈10.0g、nacl 15g、蒸储水1000ml,调ph至 7.2。na培养基：牛肉浸膏3.0g、蛋白陈10.0g、nacl 15g、琼脂15g、蒸储水1000ml, 调ph至7.2。pda培养基：马铃薯200.0g、葡萄糖15.0g、

50、琼脂15.0g、蒸储水1000ml。lb培养基：胰蛋白冻10g,酵母抽提物5g, nacl 10g,蒸储水1000ml,调ph至 7.2。ms 培养基：kno3 1.9g nh4no3 1.65g、kh2po3 0.17g、mgso4 - 7h2o 0.37g cacl2 - 2h2o 0.44g ki 0.00083g、h3bo3 0.0062g、mnso4 - 4ho 0.0223g、znso4 7ho0.0086。na2mno4 2ho 0.00025g、cuso4 5ho 0.000025g、c0ci2 - 6ho 0.000025g、 edta 0.0373g、feso4 7h2o

51、0.0278g 肌醇 0.1g、甘氨酸 0.002g、盐酸硫胺素(vbi) 0.0005g 盐酸叱哆醇(vb6)0.0005g、烟酸(vb5) 0.0005g、蔗糖 30g、6-ba 0.0005g、 2,4-d 0.002g、去离子水1000ml、琼脂8g,调节ph值至5.8。ms培养基母液配制见表 1。表1 ms培养基母液试剂用量table 1. the agentia of the medium ms stock solution试剂名称用量（g）体积（ml）大里兀系（10x）kno3 191000nh4no3 161000kh2p5 1.710007水硫酸镁（100x）mgso4 7h

52、2o 371000微量元素母液（100x）ki 0.0831000h3bo3 0.621000mnso4 - 4ho 2.231000znso4 - 7to 0.861000氯化钻（100x）cocl2 - 62o 0.00251000铝酸钠（100x）na2mno4 2ho 0.0251000无水氯化钙（100 x）cacl2 33.1510005水硫酸铜（400x）cuso4 - 52o 0.011000铁盐母液（100x）edta 3.731000feso4- 7h2o2.781000有机物母液（100x）甘氨酸0.2 1000vb10.51000vb60.51000vb50.51000

53、6-ba 母液(100x)6-ba 0.0510002,4-d 母液(100x)2,4-d 0.210002.1.3 溶液配制0.5m edta : 18.61g edta加入80ml水中，磁力搅拌器强力搅拌，用 naoh （约 2g）调ph值至8.0,定容至100ml,分装，高压灭菌。5xtbe 缓冲液：称取 tris 54g、硼酸 27.5g,并加入 0.5mol/l edta （ph8.0） 20ml, 定容至1000ml o1mol/l tris-hcl : 80ml水中?解12.1g tris碱，用浓盐酸调ph值至8.0,混匀后， 定容至100ml。x-gal贮备液：将x-gal溶于

54、二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml浓度的溶液，装入玻 璃瓶或聚丙烯管中，用锡纸包裹，贮存于-20 c。iptg（20%, w/v）溶液：将2g iptg ,溶于水中，定溶至10ml。用0.22仙m过滤器 除菌。分装成1ml小份，贮存于-20c。amp （50mg/ml）溶液：称取1g amp溶于20ml去离子水中，用0.22pm过滤器 过滤除菌，分装，-20 c保存使用。0.1mol/l cacl2：将 2.2198g无水 cac1溶于 200ml h2o,过滤除菌，4c保存。2.1.4 仪器与试剂（1）主要仪器紫外分光光度计采用日本津岛 uv-1601型；5804r高速冷冻离心机（德国epp

55、endorf 公司）；sw-cj-icu型净化工作台（江苏安泰空气技术有限公司）；wp900sl23型微波炉（顺德格兰仕电器厂有限公司）；thz-82台式恒温振荡器（购自江苏太仓市实验 设备厂）；spx型智能生化培养箱（购自宁波江南仪器厂）；dyy-10c型电泳仪（购自北京市六一仪器厂）；dyczp-33a型电泳槽（购自北京市六一仪器厂）；8302型恒 温水浴锅（北京长风仪器仪表厂）；xw-80a微型漩涡混合仪（购自上海沪西分析仪器 厂）；可调式移液器（上海雷勃分析仪器有限公司）；ldzx-40bi立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（上海中安医疗器械厂）；体视显微镜（leica公司）；pcr仪（美国伯

56、乐mycycler）； himaccr21e日本日立高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；bio-best140e凝胶自动成像系统（美国sim公司）；细胞培养板（美国corning公司）。（2）主要试剂pcr引物等合成自北京华大基因有限公司；dna回收试剂盒购自上海生物工程有限公司、pmd18-t vector试剂盒购自大连宝生物有限公司等；大肠杆菌（escherichia coli） e.coli dh5a、bl21菌株购自北京全式金；克隆载体为pmd-18t（大连宝生物公司）以及 表达载体为peasy-e1 vector （北京transgen公司）。其余试剂为进口或国产分析纯，还 包

57、括te, sds, 20mg/ml的蛋白酶k, ctab/nacl,氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇，无 水乙醇，70%乙醇，taqdna聚合酶，d.d.w,tbe缓冲液，eb染液，1%琼脂糖凝胶， 异丙醇，iptg, x-gal等。2.2试验方法2.2.1 w0314和nm0705的分子鉴定为进一步确定 w0314和nm0705是否为peba20具有不同生物膜表型的两个菌株， 并检测其生物膜相关基因tasa是否发生变异，根据徐亮（徐亮等，2008）等的分类方法， 对其tasa和16srrna进行克隆测序并与野生型菌株进行 blast比对。2.2.1.1 引物设计16s rrna扩增引物：采用16s rrna的通用引物：16sp3s8： agagtttgatcmtggctcag16sp5s15： acggytaccttgttacgactttasa克隆引物：根据genbank上所有芽抱tasa基因，采用dnaman软件和primer5.0软件分析、