基因工程常用的工具酶课件

1、基因工程常用的工具酶1 第二章第二章 基因工程常用的工具酶基因工程常用的工具酶 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 基因工程常用的工具酶2 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：简称限制酶简称限制酶。是一类能识别双链。是一类能识别双链 DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链双链 结构的核酸内切酶结构的核酸内切酶 20世纪世纪50年代发现：年代发现： 噬菌体噬菌体 E.coli B PFU10-4 E.coli B PFU1 噬菌体噬菌体 DNA被降解被降解 DNA被修饰被修饰 E.coli B 限制性核酸内切酶：降解外来限制性核酸

2、内切酶：降解外来DNA 防御防御 修饰酶：修饰酶：DNA甲基化甲基化 保护保护 寄主细胞控制的限制与修饰系统（寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！体系）！ 基因工程常用的工具酶3 一、限制酶的种类一、限制酶的种类 限制修饰活性限制修饰活性 酶蛋白结构酶蛋白结构 相对分子质量相对分子质量 切割位点切割位点 切割作用辅助因切割作用辅助因 子子 实用性实用性 代表代表 型酶型酶 型酶型酶 型酶型酶 同时存在同时存在 单独存在单独存在 同时存在同时存在 多亚基结构多亚基结构 单亚基结构单亚基结构 两两 个亚基个亚基 30万万dal 2-10万万dal 、之间之间 与识别位点不一致与识别位点不一

3、致 与识别位点一致与识别位点一致 与识别位点与识别位点 不一致不一致 Mg2+、ATP、SAM Mg2+ Mg2+、 SAM 低低 高高 低低 EcoK、EcoB Hind EcoP 基因工程常用的工具酶4 二、限制酶的命名二、限制酶的命名 命名原则命名原则 限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小 写）表示寄主物种写）表示寄主物种 菌株名位于其后菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统 Haemophilus influenzae d Hind、 Hind、 Hind

4、属名属名 种名种名 株名株名 不同限制修饰系统不同限制修饰系统 基因工程常用的工具酶5 三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性- -识别序列识别序列 识别双链识别双链DNA分子中特定的分子中特定的4 - 84 - 8对核苷酸序列对核苷酸序列 5 5 G C T G A A T T C G A G 3 3 3 C G A C T T A A G C T C 5 EcoR I的识别序列的识别序列EcoR I的切割位点的切割位点 5 5 G A G G C C G A G 3 3 3 C T C C G G C T C 5 Hae的识别序列的识别序列 Hae 的切割位点的切割位点 基因工程常用的工具酶

5、6 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列部分限制酶能识别多种核苷酸序列 5 5 G C G T Py Pu A C G A G 3 3 3 C G C A Pu Py T G C T C 5 Hind的识别序列的识别序列 Py dCMP、dTMP Pu dAMP、dGMP 基因工程常用的工具酶7 识别序列呈典型的旋转对称型识别序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构 5 5 G C T G A A T T C G A G 3 3 3 C G A C T T A A G C T C 5 EcoR I的识别序列的识别序列EcoR

6、 I的切割位点的切割位点 回文结构回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构双螺旋结构 基因工程常用的工具酶8 三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性- -切割后形成的末端切割后形成的末端 粘性末端：粘性末端： 5 5 GTGAATTCGA 3 3 3 CACTTAAGCT 5 EcoR I5 5 GTG AATTCGA 3 3 3 CACTTAA GCT 5 平齐末端：平齐末端： 5 5 GAGGCCGAG 3 3 3 CTCCGGCTC 5 5 5 GAGG CCGAG 3 3 3 CTCC GGCTC 5 Hae 彼此具

7、有互补核苷酸的单链延伸末端彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端 基因工程常用的工具酶9 三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性- -同尾酶、同裂酶同尾酶、同裂酶 同尾酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末端的一类限制酶末端的一类限制酶 5 5 GTGGATCCGA 3 3 3 CACCTAGGCT 5 BamH I 5 5 GTG GATCCGA 3 3 3 CACCTAG GCT 5 5 5 GTTGATCAGA 3 3 3 CAACTAGTCT 5 Bcl I 5 5 GTT GATCAGA 3 3 3 CAACTAG TCT 5

8、BamHIBamHI、 BclIBclI为一组同尾酶为一组同尾酶 基因工程常用的工具酶10 同裂酶同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶 5 5 GTGATCGA 3 3 3 CACTAGCT 5 Sau3A I 5 5 GAGATCCA 3 3 3 CTCTAGGT 5 MboI 5 5 GTCCCGGGGA 3 3 3 CAGGGCCCCT 5 XmaI 5 5 GTCCCGGGGA 3 3 3 CAGGGCCCCT 5 SmaI 基因工程常用的工具酶11 四、影响限制酶活性的因素四、影响限制酶活性的因素 DNA的纯度：的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、

9、蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS 增加限制酶用量增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间延长酶催化时间 DNA的甲基化程度：的甲基化程度： 反应温度：反应温度： DNA的分子结构：的分子结构： 酶缓冲液组成：酶缓冲液组成： 甘油浓度：甘油浓度： MgCl2： NaCl/KCl： Tris-HCl： -巯基乙醇巯基乙醇/二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：）： 牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSA）： 基因工程常用的工具酶12 第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶 基因工程常用的工具酶13 DNA连接酶：能够催化双链连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的片段相邻的3羟

10、基与羟基与5 磷酸基形成磷酸二酯键的酶磷酸基形成磷酸二酯键的酶 作用特点作用特点 只能连接双螺旋只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链分子，不能连接单链DNA分子；分子； DNA链上必须具有游离的链上必须具有游离的3-OH和和5-P； 只能封闭只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成 的裂口；的裂口； 需要吸能：需要吸能：ATP/NAD+ 连接方式连接方式 缺口缺口DNA: 平齐末端平齐末端DNA： 粘性末端粘性末端DNA： 5 5 3 3 OH P 5 5 3 3 OH P P OH 5 5 3 3 基因工程常用的工具酶1

11、4 基因工程中常用的连接酶基因工程中常用的连接酶 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶（T4连接酶）连接酶） 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶 热稳定性热稳定性DNA连接酶连接酶 基因工程常用的工具酶15 第三节第三节 DNADNA聚合酶聚合酶 基因工程常用的工具酶16 DNA聚合酶：能够催化聚合酶：能够催化DNA复制和修复复制和修复DNA分子损伤分子损伤 的一类酶的一类酶 作用特点作用特点 能够把脱氧核苷酸分子连续的加到能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链分子引物链的的3-OH末端末端， 催化核苷酸的聚合催化核苷酸的聚合 作用条件作用条件 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸脱氧核苷

12、酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP） 引物链：带有引物链：带有3-OH游离基团游离基团 模板：单链或双链模板：单链或双链DNA模板模板 Mg2+： 基因工程常用的工具酶17 一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 （ DNA pol I ） 酶特性：酶特性： 53聚合酶活性聚合酶活性 53核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5 dNTP Mg2+DNA pol I 3 3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5 5 5 C-G-A-G-T

13、-C-G-A-C-C-OH 5 5 C-G-A-G-T-OH 基因工程常用的工具酶18 切口平移反应切口平移反应（Nick translation） 用途：用途：制备制备32P标记的标记的DNA探针探针 53核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 3核酸聚合酶活性核酸聚合酶活性 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3

14、 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 DNase I DNA pol I Mg2+ dNTP a-32P-dATP 基因工程常用的工具酶19 二、二、KlenowKlenow大片段酶大片段酶 DNA聚合酶聚合酶 一个片段：一个片段： 53核酸外切酶活性核酸外切酶活性 另一个片段：另一个片段： 53聚合酶活性、聚合酶活性、 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 KlenowKlenow大片段酶大片段酶 KlenowKlenow大片段酶特性：大片段酶特性：53聚合酶活性聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 基因工程常用的工具

15、酶20 KlenowKlenow大片段酶大片段酶用途：用途： 补平限制酶切割补平限制酶切割DNA后产生的粘性末端后产生的粘性末端 5 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP 5 5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 基因工程常用的工具酶21 用用32PdNTP对对3凹端进行末端同位素标记凹端进行末端同位素标记 5 5 G-C-T-G-OH

16、P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdA dTTP 5 5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 基因工程常用的工具酶22 cDNA克隆中，合成克隆中，合成cDNA第二链第二链 应用应用sanger双脱氧末端中止法进行双脱氧末端中止法进行DNA测序测序 基因工程常用的工具酶23 三、三、TagDNATagDNA聚合酶聚合酶 来源来源 嗜热水生栖热菌嗜热水生栖热菌 酶特

17、性酶特性 53聚合酶活性、聚合酶活性、 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 耐高温：耐高温：7580 应用：应用：PCR技术（聚合酶链式反应）技术（聚合酶链式反应） 基因工程常用的工具酶24 PCRPCR技术技术 基本原理：类似于细胞内基本原理：类似于细胞内DNA复制过程复制过程 基本步骤基本步骤 基因工程常用的工具酶25 基因工程常用的工具酶26 特点特点 待扩增的待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间链限定在模板上的退火位点之间 待扩增待扩增DNA链得到迅速大量扩增链得到迅速大量扩增 反应体系组成反应体系组成 影响因素影响因素 模板模板 dNTP DNA聚合酶聚合酶 引物引物A、B

18、MgCl2 引物的设计引物的设计 退火温度退火温度 MgCl2浓度浓度 基因工程常用的工具酶27 第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶 基因工程常用的工具酶28 一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶 末端转移酶（末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化）：在没有模板存在的条件下，能催化 dNTP随机加于随机加于DNA分子的分子的3-OH端端 5 p 3 HO OH 3 p 5 TDTMg2+ dATP AAAAAAAAAAAA OH 3 5 p 3 HOp 5 同聚物尾巴同聚物尾巴 Poly（dA） 基因工程常用的工具酶29 作用底物：作用底物： 带带3-OH末端的单链末端的单链DNA 5 pOH 3 TDTMg2+ dATP AAAAAAAAAAAA OH 3 5 p 基因工程常用的工具酶30 带带3-OH单链突出末端的双链单链突出末端的双链DNA 5 p 3 HO OH 3 p 5 TDT Mg2+ dATP 5 p 3HO AAAAAAAAA