基因克隆步骤完整版

1、精品文档1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1ml Trizol 加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min；打开离心机预冷(3) 加200此氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层； 4 C, 12,000g，离心 15 min ;(5) 取上清，加500此异丙醇，混匀，室温放置10 min ; 4 C, 12,000g，离心 10 min ;(7) 弃上清，加1 mL75醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100汇醇清洗(8) 4 C, 7,500 g，离心 5 min ;(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，

2、加50丄DEPC 水，80oC保存。此操作中所用到的器皿均需经过 DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经 RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD6。值为核酸的吸收值，OD8。 值为蛋白的吸收值，OD60/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范 围内，可正常使用；此外还有OD230 值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸Oq/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总 RNA浓度(他/mL) =A6怖释 倍数卅0。4 欢。迎下载2 反转录 /cDNA 第一链的合成纯化RNA以去除基因组 DNA操作按TaKaRa公司的PrimeScript RTrea

3、gentwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为:Total RNA1pg5XgDNA Eraser Buffer2pLgDNA Eraser1pLRNase Free dH2O补齐至 10pL条件为: 42oC， 2min；RNA屯化后，即可进行反转录。其体系为:5PrimeScript Buffer 2( for Real Time )4PrimeScript RT en zyme mix I1 pLRT Primer Mix1 pL上一步的反应液10pLRNase Free dH2O补齐至 20pL操作条件为: 37 C放置 15 min

4、 ; (2) 85 C, 5 sec ; (3) 4 C保存。3 PCR按 TaKaRa公司的 Premix Taq Version 2.0 操作，PCF反应体系如下:Premix Taq25 pL模板5pL引物 1 (10pM)1pL引物 2 (10pM)1pLddH2O18pLPCR反应条件为：94C 预变性 5min； 94C 变性 30s, 53C 退火 30s, 72C 延伸30s,循环36次；72OC延伸10min。PCR反应完毕，取5PL反应产物进行1%K脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用 10pL 反应产物）。4 基因克隆及测序4.1 PCR 产物切胶回收将PCR产物用1%琼脂糖凝胶

5、进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的 DNA片段。使用 TIANGEF公司的 Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下： 平衡吸附柱：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入 500 pL平衡 液BL, 13,400 x g离心1 min,倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2重新套回收集 管中；(2) 按100 mg agarose胶加入100 pL溶液PC 置于50oC中10 min左右， 中途混匀几次，至胶完全融化；(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温下13,400 x g离心1 min，倒掉收集管中的废液

6、，吸附柱 CB2重新套回收集管中； 向吸附柱CB2中加入600丄漂洗液PW(加乙醇)，室温下13,400 x g离 心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(5) 重复上一步骤；(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400 xg离心2 min,尽量除去 漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(7) 将柱子套入一新的灭菌 1.5 mL 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 50丄洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400 x g室温离心2 min,收集到的洗脱 液即为回收的DNA纯化液；(8) 取5此的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液

7、 中DNA含量。4.2 目的片段与载体连接(1) 胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂 盒说明书。在灭菌的 0.5 mL 离心管中配制如下溶液( 10 pL)：4pL5pL1pL回收 DNALigation Solution pMD18-T Vector16 C反应30分钟，所得产物保存于-4C冰箱备用4.3连接产物转化E.coli DH5a(1)将5丄连接产物加入到lOOLE.coli DH5a感受态细胞中，轻轻旋转 离心管混匀内容物，冰上静置 30 min ；42 C水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min ;(3) 每管加入500此LB

8、培养基 (室温放置)， 37oC 160-180 rpm 振荡培养45-60 min ，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有Amp( 100旧/mL)的选择性平板上加入 60-100此 菌液，用无 菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用 Parafilm 膜封好；(5) 将培养皿正放， 37oC 约 50 min ，待液体全部吸收后，倒置平板继续培 养 10-16 h 。4.4 转化子的筛选及鉴定(1) 用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5 mL LB液体 培养基 中(含 100 他/mL Amp)，37oC, 165rpm振荡培养 10-12 h ;(2) 用5此菌液做模板，进行PCF鉴定(50此体系)，操作步骤同3。