KRAS基因在胰腺疾病中突变的检测及其临床意义

1、【摘要】目的：探讨KRAS基因突变在胰腺疾病中的临床意 义和在胰腺癌诊断中的价值。 方法：合酶链反应一单链构象多态性分析 （PCR-SSCP） 方法 分别检测胰腺癌、癌旁组织、手术切缘正常组织、慢性胰腺炎 石蜡包埋组织的KRAS突变并进行DNA测序确认。结果胰腺癌K RAS 12密码子突变率 （792%）显着高于慢性胰腺炎 （33 3 % ， P0 . 01），且在切缘正常组织一癌周导管增生一癌周不典型增 生一胰腺癌过程中，突变率有逐渐上升的趋势。突变方式以 12 密码子 GGT-GAT 、GTT、CGT 为主，同一例患者突变方式一致。 KRAS 基 结论：KRAS基因突变在胰腺癌发生中起作用

2、，但 因突变作为胰腺癌诊断的分子标志缺乏特异性。 【关键词】胰腺癌；慢性胰腺炎；KRAS基因；突变 胰腺癌临床确诊时大多已属晚期，其 5年生存率仅为 1 5。提高其早期发现率可使更多患者获得手术切除的机会而 提高其生存率。众多研究表明，KRAS基因与胰腺癌高度相关， 其第一外显子 12密码子的点突变在胰腺导管腺癌组织中高达 70%100 %，且是胰腺肿瘤发生的早期事件，可用于早期诊 断胰腺癌。而近来研究却表明，KRAS突变亦可见于良性胰腺疾 病及正常胰腺，对它可作为胰腺癌早期诊断的分子标志提出了 疑问。本研究旨在探讨KRAS突变在胰腺疾病中的临床意义和在 胰腺癌诊断中的价值。 材料和方法 1对

3、象选择：收集上海长海医院1996年1月至2000 年2月 。包括：胰 良恶性胰腺疾病术后石蜡包埋组织标本，诊断由手术及病理证 实，所有病例均有完整的手术记录资料及临床资料 腺导管腺癌患者的胰腺导管腺癌 24 例、癌旁胰腺导管增生 58例、 癌旁胰腺导管不典型增生 19例和手术切缘正常胰腺 16 例；恶性 胰腺黏液性囊腺瘤 1 例；慢性胰腺炎 24 例，选择胰腺导管增生 组织蜡块，慢性胰腺炎患者经15年随访全部健在，且无一例 发展为胰腺癌。 7例正常胰腺组织为非胰腺疾病患者尸检标本。 胰腺癌细胞株 Patu 一8988 由德国 Marbury 市 Philips 大学分子生物学和分子病理学研究所

4、 Elsasserlt 士 惠赠。 2 .标本处理：每份标本一部分切成5 m薄片，HE染色光 镜下组织鉴定，另取 10 m 薄片 3 5片（表面积约 10 cm2） 放 入1 5 ml 消毒塑料离心管中， 经二甲苯脱蜡， 乙醇漂洗， 离心 后干燥沉淀物。 3 DNA 的提取：采用柱离心式小量组织基因组DNA 抽提 试剂盒 （上海华舜生物工程公司 ），按说明书操作。经纯度鉴定 后一 20 C备用。 4 半巢式聚合酶链反应 （PCR） ：引物合成：由上海生工生 物工程公司合成，其序列为 R1=5 ACT GAATATA A ACTTGTGGTAGTTGGACCT 3 ： R2 ：R3=5 =5 T

5、CAAAGAATGGTCCTGGACC 3 TAATATGTCGACTA A A ACAAGATTTACCTC 3 配对方式为 R1 R2, R1. R3。半巢式PCR需经2次PCR , 1次酶切。DNA扩增仪为Perkin-Elmer 9600 型，PCR试剂盒购 于Promega 公司的PCR Core系统。PCR反应总体积50 l，含4 种dNTP，浓度各 0.2 mmol /L, MgC12 1.5 mmol /L, PCR 缓冲液1 X （不含MgC12），引物浓度各为1mol /L, Taq酶 1 . 25U / 50 l。每次PCR均设臵阴、阳性对照各1例，阳性对照 所用模板及引

6、物系Promega公司配给。R1和R2为引物，PCR 参数为95 C、5 min预变性，加入 Taq酶，94 12 1 min , 52 C 1 min , 72 C I. 5 min，循环25次，最后72 C 5 min。扩增片段为 157 bp，酶切条件为50 l反应体系中含 0. 25 l BstN1（Bio-lab 公司）、0. 5 l BSA、5 I缓冲液，60 C酶切2 h，煮沸灭活酶。 取2 l酶切产物用作第2次PCR模板，R1和R3为引物，PCR条件 同前，惟循环次数为3O次。扩增片段为135 bp，取8 l产物作2% 琼脂糖凝胶电泳分析。 5 .单链多态构象性分析（SSCP）

7、:为寻找基因变异，每一 被检样本均在 12%非变性聚丙烯酰胺凝胶下进行电泳，观察 SSCP条带情况。以正常人外周血白细胞DNA扩增产物为阴性 4C、 对照、胰腺癌细胞株 Pam-8988 DNA 扩增产物为阳性对照， 电 泳前将PCR产物煮沸5 min热变性，立即臵冰浴，然后经 35V电泳，电泳21 h左右，至二甲苯青距胶底部约 0 . 5C1TI , 结束电泳，以银染显示条带，照相分析。对每个样本均经23 次电泳以保证实验的准确性。 6 . DNA测序：所有经PCR-SSCP筛选分析、显示条带异 常的胰腺癌和慢性胰腺炎患者的 PCR产物经胶回收式纯化、克隆入 pUCm-T 载体中，并进行插入

8、片段的序列分析。测序用 PE 公司测序试剂盒， 在PE公司ABI PRISM 377 DNA测序仪上进行。 7 .统计学分析：应用SAS统计软件，采用丫检验、Fisher 确检验和 t 检验。 结果 1 KRAS 12密码子突变检测结果：由表 1可知，由切缘正 常组织一癌周导管增生组织一癌周不典型增生组织一胰腺癌组 织的过程中， KRAS 12密码子突变率有逐渐上升的趋势，且胰 腺癌组突变率明显高于正常胰腺、慢性胰腺炎、切缘正常组织 及癌周导管增生组 （P0 01）。 突变方式以 12密码子 GGT-GAT 、 GTT、 CGT 为主，未见 13密码子突变 （表2） 。 2胰腺癌组织 KRAS

9、 12 密码子突变与临床病理指标的关系： 由表3可知，胰腺癌组织 KRAS 12密码子突变与各临床病理参数 无明显相关性。 3KRAS 12 密码子突变与慢性胰腺炎临床状况的关系： 由表4可知， KRAS 12密码子突变与慢性胰腺炎各项临床参数无 明显相关性。 口 号， RAS为一基因家族， 转导了 RAS基因的NIH/3T3细胞能发生转化，从而确定了 其癌基因的地位。RAS突变能导致保守区氨基酸序列改变，产 生持续性刺激信号，导致细胞持续生长。 文献报道胰腺癌KRAS突变率高达70%100 %,且几乎都集中 于第 1 外显子的 1 2密码子。 KRAS 1 2密码子的野生型为 GGT ， 突

10、变型常见为GAT、GTT、CGT，此三种类型占所有突变类型 的60 %100 %。Cerny等在亚硝胺诱发叙利亚仓鼠胰腺癌 的模型中发现，在诱变剂作用下，胰腺导管腺癌发生之前存在 小灶性增生、乳头状增生和原位癌的序列性导管损伤，其中均 可检测到KRAS基因异常，因而认为K RAS突变是胰腺导管腺癌 发生的早期事件。因此，KRAS突变可能预示着潜在的早期胰腺 癌，这也就是KRAS基因突变的早期诊断价值之所在。而最近 Rivera 等在 42例慢性胰腺炎患者中筛选出 11 例存在导管增生 者为实验组，4例无导管增生者为对照组检测KRAS突变，应用 显微切割法 (microdissection) 在

11、组织切片上精确地切割胰腺 导管上皮，经抽提DNA、PCR扩增、探针杂交、DNA直接测序， 结果示实验组18 % (2 /11)患者存在KRAS突变，对照组均为阴 性，因而得出：慢性胰腺炎有胰腺导管增生且存在 KRAS突变是 慢性胰腺炎向胰腺癌发展的潜在原因。对 774 例慢性胰腺炎患 者(1991 1999 年)的回顾性分析表明， KRAS12 密码子平均突 变率为13 % J。而最近对2 015例慢性胰腺炎患者的流行病学 研究发现，慢性胰腺炎患者发生胰腺癌的危险性较正常人群显 着为高， 而且胰腺癌的发生与慢性胰腺炎病程呈正相关， 经10、 20年的随访，分别有 2%和 4%的慢性胰腺炎发展为

12、胰腺癌，从 而提出， 慢性胰腺炎倾向于向胰腺癌发展 H J 。一个正常细胞转 化为恶性表型之前必须经历多种变化，有研究发现，胰腺癌周 组织发生胰腺导管增生显着高于非恶性对照组，与癌变模型极 相似，提出可能由胰腺导管增生向胰腺癌发展。 Luttges 等 J 发现，KRAS突变阳性的胰腺导管腺癌，其癌旁组织胰腺导管增 生亦存在KRAS突变。因此，目前认为，慢性胰腺炎与胰腺导管 腺癌的相关性本质上是由于慢性胰腺炎中存在胰腺导管增生， 其被认为是胰腺导管腺癌发生中的一个环节，KRAS突变是此种 细胞演进过程中的分子事件。 目前KRAS突变存在在研新药安卓 健，司美替尼。 表明KRAS突变在胰腺癌 是否合并胰岛 期随访慢性胰腺 是否可作为胰 本研究中胰腺癌KRAS基因突变率（79 %）显着高于慢性胰 腺炎（33 . 3%），表明以KRAS基因为分子标志诊断胰腺癌敏感 性较高，但缺乏特异性。进一步发现，在切缘正常组织一癌周 导管增生组织一癌周不典型增生组织一胰腺癌组织的过程中， KRAS突变率有逐渐升高的趋势， 且发现无KRAS突变的胰腺癌， 其癌旁和手术切缘各种组织均无 KRAS突变。对突变者的PCR 产物测序发现，胰腺癌与慢性胰腺炎 KRAS 12 密码子突变方式 均表现为 GGpGAT 、GTT、CGT ，且同一例患者突变方式一致。 此虽与