westernblot原理及步骤

1、westernblot原理及步骤Wester n blot 基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从 SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Wester n blot 应用：目的蛋白的表达特性分析；目的蛋白与其他蛋白的互作；目的蛋白的组织定位；目的蛋白的表达量分析；蛋白样品的制备：1水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；2有机溶剂提取法；3离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强；4通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。Wester n blot注意事项和常见问题:1我的细胞提取

2、液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度，同时将样品煮沸时间延长； 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液 即可。2我做的蛋白质分子量很小（10 KD ），请问怎么做 WB ?答：可以选择0.2 阿 的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再 转移。3最后显色时用 DAB好还是ECM好？答：DAB有毒，但是比较灵敏，是 HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制， 但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级蛋白， 具体可以根据你实验的情况。4要验证某个细胞上有无该蛋白的存在， 需要做免疫组化和we

3、stern blot 试验 吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Wester nblot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定 量，但是不能定位。两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么 实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。5细胞水平要做 western blot ，多少细胞提的蛋白够做 western blot ?答：一般5 X106就足够了。6同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对 western blot 有无影响？答：能，没有问题。7同一蛋白样品能同时进行

4、两种因子的 Wester n Blot 检测吗？答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。8蛋白变性后可以存放多久？答：-80 C, 一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。9二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后， 封闭液是否要作调整，能否再用 5%的脱脂奶粉呢？答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点。10做组织样品的western的时候，怎样处理样品？答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋 白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。

5、还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。11免疫组化和 Western Blot 可以用同一种抗体吗？答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表 位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮 后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于 免疫组化。12在做Western Blot 时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化

6、 PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。13检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？答：可以。14蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小 21KD，中至66KD，大至170KD， 可以一次做好吗？答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12 %SDS-PAGE，湿转120mA ,45-60min 就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用 7% SDS PAGE，200mA 90-120min 。15细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗

7、？答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。16 PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复 洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋 白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢， 不易脱落，结果较好。17 westernblot内参选择什么合适？答：这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参B-actin、GAPDH和Tubulin ;线粒体蛋白则可选择内参 VCDA1/Porin

8、和COXIV ;核内 抗原可以选择内参 Lamin B1、TBP和histone。18不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？答：转移缓冲液中加入20%甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率， 但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量 蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率; 使用戊二醛交联；降低凝胶浓度，如低至 6-7%或提高转膜电压/电流，增加转 移时间。19转膜时凝胶肿胀或卷曲？答：可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡 5-10min。20跑胶的条带歪斜或者漂移？答：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构

9、不紧凑导致，可更换或者在 两块海绵之间垫上少许普通的草纸。21转膜后膜上有单个或多个白点？答：转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。转膜缓冲液过热?22答：缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。23显影后胶片背景太高？答：转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤 次数；封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二 抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少 曝光时间。24结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？答：样品中不含靶蛋白或者含量太低， 可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白 的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染 色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。25目的条带位置偏低或者偏高？答：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。26有非特异性条带? 答：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本 身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特 异性引起的结果，可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非 特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白 酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗