肿瘤的分子生物学检验技术课件

1、第十五章 线粒体病的分子生物学检验技术 滨医附院检验科 袁笑 q“千手观音” 21位聋哑演员中 18人有药物史 q部分患者使用正常 剂量也会致聋 q“一针致聋”现象 线粒体基因突变（线粒体基因突变（A1555GA1555G）+ +环境（使用氨基糖苷类）环境（使用氨基糖苷类） 线粒体（Mitochondrion） 3 1. 1. 真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命1010天天 2. 2. 多数细胞含几个到几千个线粒体多数细胞含几个到几千个线粒体 3. 3. 每个线粒体含每个线粒体含2-10 2-10 线粒体线粒体DNA（mtD

2、NA） 线粒体的主要功能 1、参与人体很多重要 的生物化学过程生物化学过程（三 羧酸循环、脂肪酸 氧化、氨基酸分解 代谢、血红素合成 和部分尿素合成过 程）被称为“细胞的 能量工厂” 2、线粒体体积大小， 数量增减反应器官功器官功 能负荷的变化能负荷的变化。 第一节 线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统 第一节 线粒体基因组与线粒体病 人体细胞中的线粒体DNA具有自主的DNA复制、转录功能， 为非孟德尔遗传方式，故称为25号染色体。 25号染色体号染色体 7 （一）人类线粒体基因组 1、基因组小, 16569 bp 2、双链环状DNA外环富含鸟 嘌呤称为重链，内环富含胞 嘧啶称轻链

3、 3、1）编码区 13 结构基因 / mRNA 22 tRNA 基因 2 rRNA 基因 2）非编码区 D-loop（约1120bp） L链复制起始区（约30 50bp，tRNAAsn-tRNACys） 一、线粒体基因组及其表达系统 1、结构基因 7 7个个为为NADH-CoQ还原酶复合体（复合体复合体）的亚基（）的亚基（ND1ND1、ND2ND2、ND3ND3、 ND4LND4L、ND4ND4、ND5ND5和和ND6ND6） 1 1个个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复合体（复合体复合体） 中细胞色素中细胞色素b b的亚基的亚基 3 3个个为为构成细胞色素c氧化酶（COX）复合

4、体（复合体复合体）催化活性中）催化活性中 心的亚单位（心的亚单位（COXCOX、COXCOX和和COXCOX） 2 2个个为为ATP合酶复合体（复合体复合体）F0F0部分的部分的2 2个亚基（个亚基（A6A6和和A8A8） 1、结构基因 2、tRNA基因 22个tRNA 基因 可转录20种tRNA 满足线粒体内蛋 白质翻译的需要。 tRNA LeutRNASer 都有2个基因外， 其余18种均只有1 个基因。 3、rRNA基因 1、mtRNA 编码 两种rRNA,即 12SrRNA16SrR NA 2、位于H链 tRNA PhetRNALeu 之间以tRNA Val相 隔 3、变异常发生在 二

5、级结构茎环上 。 4、非编码区 D-loop（约1120bp） 位于tRNAPro 和tRNAPhe基因之间， 约1120bp,是mtDNA中 变异最多的区域，参与 并调控mtDNA的复制和 转录。 L链复制起始区（约 3050bp， tRNAAsn-tRNACys 可折叠成茎环结构。 （二）线粒体基因表达系统及特点 l1 1、密码子、密码子 1979年，年，Barrell 报道了人线粒体报道了人线粒体DNA所用的遗传密码。所用的遗传密码。 通用遗传密码和线粒体遗传密码的差异通用遗传密码和线粒体遗传密码的差异 密码子密码子线粒体线粒体DNADNA编码编码核核DNADNA编码编码 UGAUGA色

6、氨酸色氨酸终止终止 AUAAUA起始起始异亮氨酸异亮氨酸 AGGAGG终止终止精氨酸精氨酸 （二）线粒体基因表达系统及特点 l2 2、mtDNAmtDNA复制特点复制特点 lD环复制为主要模式，重链以逆时针方向复制， 轻链以顺时针方向复制。 lnDNA只在细胞分裂时复制，mtDNA一直处于 分裂状态，并由nDNA编码的调控因子控制。 mtDNA复制特点 mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（OH）与L链复制起始点（OL） 相隔2/3个mtDNA。复制起始于L链的转录启动子，首先以L链为模板合成一段 RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，复制一条互补的H链，取代亲 代H链与L

7、链互补。被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置 换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。 （二）线粒体基因表达系统及特点 l3 3、mtDNAmtDNA转录的特点转录的特点 l对称性转录，重链启动子启动重链顺时针方向 转录，轻链启动子启动轻链逆时针方向转录。 l成熟的mRNA只在3末端加polyA尾巴，5 末 端不修饰帽子结构 （二）线粒体基因表达系统及特点 l4 4、线粒体蛋白质的合成特点、线粒体蛋白质的合成特点 自主编码合成13个多肽，其余功能所需蛋 白均由核基因组编码，与细菌合成蛋白质体系 十分相似。“共生学说” 18 核基因组编码核基因组编码 了了15001500

8、多个线多个线 粒体蛋白粒体蛋白 线粒体基因组线粒体基因组 只编码了只编码了1313条条 多肽链多肽链 “交叉对话（交叉对话（cross-talkcross-talk）”机制机制 （三）mtDNA与nDNA的相互关系 1、nDNA的表达状况可 直接影响和调控mt DNA 的表达和线粒体蛋白质 的生物合成。 2、 mt DNA突变可直接 影响mt DNA所编码蛋白 多肽的合成，而影响有 氧呼吸、物质代谢和能 量代谢，并进一步通过 线粒体功能变化反馈影 响nDNA的复制和表达。 3、各种转录因子是其通讯的基础。 “交叉对话（交叉对话（cross-talkcross-talk）”机制机制 二、线粒体病

9、的概念 l因线粒体功能受损或缺陷而导致的疾病。 l主要累及大脑和肌肉组织。 l分为线粒体肌病，线粒体脑病、线粒体脑肌病 21 三、线粒体病的特征 （一）母系遗传 与遗传早发 线粒体疾病的母系遗传 (二)同质性突变与异质性突变与发病阈值效应 24 线粒体基因线粒体基因 q同质性（同质性（Homoplasmy） q0 或或 100% q异质性（异质性（Heteroplasmy） q 0-100% 核基因核基因 q纯合子（纯合子（Homozygous） q0 或或 100% q杂合子（杂合子（Heterozygous） q50% mtDNA同质性/异质性突变与阈值 25 u线粒体线粒体DNADNA的

10、突变率极高，约比核的突变率极高，约比核DNADNA高高10-2010-20倍。倍。 线粒体DNA排列紧凑，没有内含子，任何mtDNA的突变 都可能影响其基因组的重要功能； 线粒体DNA缺少组蛋白的保护； 线粒体DNA容易被呼吸链生成自由基氧化损伤； 线粒体中没有DNA损伤的修复系统； 四、线粒体病的分子生物学检验标志 四、线粒体病的分子生物学检验标志 l（一）mtDNA碱基位点 l1 1、点突变、点突变 1）结构基因点突变包括同义突变和错义突 变，错义突变导致氨基酸的替换，由此引起蛋 白质结构和功能的改变，导致疾病。 lLeberLeber视神经病（视神经病（LHONLHON）：）： lG11

11、778AG11778A（在（在ND4ND4基因），基因），G3460AG3460A（在（在ND1ND1基因）基因） 1 1、点突变、点突变 2）tRNA基因的点突变，可以降低线粒体内蛋 白质的生物合成的能力，从而影响线粒体氧化 磷酸化的功能，导致疾病的发生。 lMELASMELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒 中样发作）：中样发作）： lA3243G (80%), T3271CA3243G (80%), T3271C（在（在tRNA Leu(UUR)tRNA Leu(UUR)基因）基因） 四、线粒体病的分子生物学检验标志 2、单核苷酸多态性位点 单个核苷

12、酸变异引起的mtDNA序列的多态性，与 不同人群有关。 3、线粒体单体群 在进化过程中，母系遗传的 mtDNA为适应环境所形成的碱基位点多态性集 合。 （二）（二） mtDNAmtDNA缺失或插入片段缺失或插入片段 大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。 大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体 OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的 功能。 常见缺失：常见缺失： 848384831345913459：Kearns-SayreKearns-Sayre综合症（综合症（KSSKSS）、）、 缺血性心脏病缺血性心脏病 ； 86371

13、6073：与衰老有关的退行性疾病； 438914812：能量代谢受到严重破坏 。 （二）（二） mtDNAmtDNA拷贝数的变化拷贝数的变化 lmtDNA拷贝数可作为评价线粒体功能的指标，当拷贝数减 少时导致细胞能量缺乏，由此引发疾病，在胃癌、食管鳞 癌等肿瘤细胞中mtDNA拷贝数下降，有可能成为一种新的 肿瘤标志物。 第二节 线粒体病分子生物学检验技术及质量控制线粒体病分子生物学检验技术及质量控制 一、线粒体病分子生物学检验策略 二、线粒体病的分子生物学检验技术 l（一）PCR-RFLP技术 PCR-RELP的质量控制的质量控制 l（1）模板DNAD的制备和引物设计：设计合适的引 物扩增目的

14、模板DNA l（2）酶的选择：去除干扰物质，根据酶活性要求选 择适宜的缓冲液、活性剂等，酶的用量不超过总体积 的10%。 l（3）PCR扩增体系和酶切反应条件：优化保证PCR 产物的纯度和精度，设计好酶切反应体系，根据内切 酶活性，适时终止反应。 l（4）结果分析：根据酶解片段选择不同浓度的琼脂 糖或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，染色后观察扩增 基因的变异情况。 二、线粒体病的分子生物学检验技术 l（二）变性高效液相色谱法 l在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体 在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源 双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在 部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在

15、 而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源 双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双 峰或多峰的洗脱曲线。 DHPLC检测的质量控制 l1、 DHPLC检测的样本要求 l（1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。 l（2）样品质量：检测前不许纯化，核苷酸和引物 会很早被洗脱，模板大分子在样品峰后洗脱。引 物二聚体和非特异性扩增及碱基数类似的污染物 需优化PCR去除。 l（3）样品含量：PCR浓度必须足够大，要求2微 升产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带，相当于 浓度至少20ng/ul. l（1）PCR引物的设计：引物长度200-500bp范围， 且只有一个溶解区域，无错配的PCR片段

16、 l（2）PCR反应条件的优化，控制好温度和时间达到 模板双链完全变性、复性 l（3）DHPLC检测上样前要验证PCR产物质量，以保 证结果准确性。 l（4）结果分析：在部分变性条件下出现异源双链峰， 表明异质性突变位点，反之则为同源单峰。建议购买 阳性质控品。 2、DHPLC检测的条件优化 二、线粒体病的分子生物学检验技术 l（三）DNA芯片技术略 l（四）DNA测序技术略 三、线粒体病的分子生物学检验应用 l（一）（一）MELASMELAS综合征综合征 l11月23日，读初三的晓炎从学校回家后，顾春娜就感觉女儿脸色 不好，以为晓炎在学校吃的没有营养，就赶紧给女儿做了顿好饭。 可晓炎吃过饭后

17、不久，就开始呕吐。 l当晚凌晨2点钟，晓炎出现了全身抽搐的症状，看到女儿四肢 颤抖，嘴眼歪斜，顾春娜赶紧拨打120，急救车将女儿送到医院救 治。 l入院后的晓炎，直接被送进了ICU重症监护室。经过医院的多 次检查，也没有最终确诊，院方建议顾春娜带晓炎去北京治疗。 到了北京儿童医院，终于确诊晓炎患上的是一种因遗传基因的缺 陷而导致的线粒体结构和功能的异常，病症名称为线粒体脑肌病。 MELAS综合征发病特点 l母系遗传 l1040岁发病，10岁前发育正常。 l首发症状为运动不耐受、卒中样发作、偏轻瘫、 失语、皮层盲或聋。并有肢体无力、抽搐或阵 发性头痛、智能低下痴呆及乳酸血症 MELAS基因 l已

18、发现4种点突变与大多数MELAS病例有关，其 中2种分别在第A3243G、T3271C位核苷酸，最 常见其中80%是A3243G的突变 45 399bp 307bp 92bp M Un-cut 143B 43B 1 2 PCR-RFLP（限制酶（限制酶 Apa） PCR-DHPLC WT A3242G mt3243 突变DNA序列测定 3243 正常序列 突变杂合子 三、线粒体病的分子生物学检验应用 （二）（二）LeberLeber遗传性视神经病变遗传性视神经病变 Leber遗传性视神经病是以 德国眼科医生Theodor Leber 的名字命名的，又称Leber视 神经萎缩，为一种急性或亚急

19、性发作的母系遗传病，男女病 人比例5:1，至今尚未发现一 个男性患者将此病传给后代。 视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表现急视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表现急 性亚急性视力减退，性亚急性视力减退，中心视野丧失明显，中心视野丧失明显，导致失明。导致失明。 突变位点突变位点基因基因同质性同质性/异质性异质性首次报道首次报道* G3316A ND1 同质性同质性Saillard et al.(2000) T3394C ND1同质性同质性 Hofmann et al.(1997) G3460A*ND1同质性同质性/异质性异质性Huoponen et al.(1991) C3497T ND1

20、同质性同质性 Kong et al.(2003） G3733AND1同质性同质性/异质性异质性Valentino et al.(2004) C4171AND1同质性同质性/异质性异质性Kim et al.(2002) T4216C ND1 同质性同质性Torroni et al.(1994） A4435GtRNAMet同质性同质性Herrnstadt et al.（2002） G7444ACO同质性同质性Huoponen et al.（1993） T10663CND同质性同质性Brown et al.(1995) G11696AND4同质性同质性/异质性异质性Zhou et al.（2006）

21、 G11778A*ND4同质性同质性/异质性异质性Wallace et al.(1988) T12338CND4同质性同质性Wong et al.（2002） G14459AND6 同质性同质性/异质性异质性Jun et al.(1994) C14482G/AND6 同质性同质性/异质性异质性Howell et al.(1998) T14484C*ND6同质性同质性/异质性异质性Johns et al.(1992) A14495GND6异质性异质性Chinnery et al.(2001) T14502CND6同质性同质性Ozawa et al.（1991） C14568TND6同质性同质性W

22、issinger et al.(1997) A14693GtRNAGlu同质性同质性/异质性异质性Tzen et al.（2003） A15951GtRNAThr同质性同质性Li et al.（2006） School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College49 q原发性突变：原发性突变：G3460A， G11778A，T14484C 的突变，占全部的突变，占全部 LHON的的 80-90 q继发性突变：继发性突变： T3394C ，T4216C ， C4019T，G5244A ， C4777T，G9438A ， G13708A ，G15

23、257A q新突变：新突变： A4435G q位于位于tRNAMet 基基 因因 q可以可以调节调节ND4 G11778A 突变突变的的 外显率外显率 l11778GA 90. 9%,3460GA 1. 8%, 14484TC 7. 3% 是目前公认的致病性最强的 三种原发性突变 l11778GA发病时视力多低于0.1，视力预后也 最差；14484TC发病时视力及视力恢复情况明 显好于11778GA患者 11778GA导致编码NADH 脱氢酶亚单位4(ND4)中第340 位的Arg精His组，改变ND4 空间构型，NADH脱氢酶活性 降低，线粒体产能效率下降， 视神经细胞提供能量不能长 期维持

24、视神经完整结构，导 致神经细胞退行性变、死亡。 11778 GA lLeberLeber病变相关的病变相关的mtDNAmtDNA突变常用检测技术突变常用检测技术 lPCR-RFLPPCR-RFLP技术技术 lPCR-SSCPPCR-SSCP技术技术 lDHPLCDHPLC技术技术 lDNADNA测序技术测序技术 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College52 G3460A， G11778A，T11484C原发性突变测序图原发性突变测序图 三、线粒体病的分子生物学检验应用 （三）药物性耳聋 突变位点突变位点基基 因因同质性同质性/

25、异质性异质性疾疾 病病首次报道首次报道a T961delT+C(n)ins 961insC 12S rRNA同质性同质性 药物性耳聋药物性耳聋/ 非综合征型耳聋非综合征型耳聋 Bacino et al.(1995) Tang et al.(2002) T1095C12S rRNA同质性同质性/异质性异质性 药物性耳聋药物性耳聋/ 非综合征型耳聋非综合征型耳聋 Thyagarajan et al. (2000) C1494T 12S rRNA同质性同质性 药物性耳聋药物性耳聋/ 非综合征型耳聋非综合征型耳聋 Zhao et al.(2004) A1555G 12S rRNA同质性同质性/异质性异

26、质性 药物性耳聋药物性耳聋/ 非综合征型耳聋非综合征型耳聋 Prezant et al.(1993) G1606AtRNAVal异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Tiranti et al.(1998) A3243G tRNALeu(UUR)异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋 van den Ouweland, et al.(1992) G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性 药物性耳聋药物性耳聋/ 非综合征型耳聋非综合征型耳聋 Pandya et al.(1999) A7445G CO1/ tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性非综合征型耳聋

27、非综合征型耳聋Reid et al.(1994) 7472insC tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Tiranti et al.(1995) T7511C tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性非综合征型耳聋非综合征型耳聋Sue et al.(1999) T7512CtRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Nakamura et al. (1995) A8344G tRNALys异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Shoffner et al. (1990) G8363AtRNALys异质性异质性综合征型耳

28、聋综合征型耳聋Santorelli et al. (1996) T14709CtRNAGlu同质性同质性综合征型耳聋综合征型耳聋Rigoli et al.(2001) G15927AtRNAThr同质性同质性 药物性耳聋药物性耳聋/ 非综合征型耳聋非综合征型耳聋 Wang et al.(2008) 第二节 线粒体基因组与耳聋 耳聋相关的耳聋相关的mtDNAmtDNA突变的检测突变的检测 lPCR-RFLPPCR-RFLP技术技术 lDHPLCDHPLC技术技术 lDNADNA测序技术测序技术 l基因芯片技术基因芯片技术 55 检测位点检测位点引物序列引物序列(53)退火温度退火温度() 产物长

29、度产物长度(bp) A1555G C1494T CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT 58802 TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA A7445G ACG CCA AAA TCC ATT TCA CT 58987 CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT 三、线粒体病的分子生物学检验应用 （四）线粒体糖尿病 l线粒体糖尿病线粒体糖尿病 l美国糖尿病协会美国糖尿病协会(1997)/(1997)/世界卫生组织世界卫生组织(1999)(1999)制定了新的糖制定了新的糖 尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型

30、糖尿病列为特殊类型糖 尿病，属于尿病，属于 细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的 1 13 3 l据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率 为为2.96%2.96% 突变位点突变位点累及基因累及基因同质性同质性/ /异质性异质性疾病疾病首次报道首次报道 C1310T12S rRNA同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Guan et al. (2010) A1438G12S rRNA同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Vawter et al.(2009) A3243G*tRN

31、A Leu (UUR)异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Van den et al.(1992) C3254AtRNA Leu (UUR)异质性异质性妊娠糖尿病妊娠糖尿病Ng et al. (2000) T3264CtRNA Leu (UUR)异质性异质性糖尿病糖尿病Matsuoka et al.(1997) T3271CtRNA Leu (UUR)异质性异质性糖尿病糖尿病Jaksch et al. (1995) G3316AMT-ND1同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Ogihara et al. (1995) T3394CMT-ND1同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病

32、非胰岛素依赖性糖尿病Wallace et al. (1995) T3398CMT-ND1同质性同质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Jaksch et al. (1995) A3399TMT-ND1同质性同质性妊娠糖尿病妊娠糖尿病Ng et al.(2000) T4291CtRNA Ile同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Lifton et al. (2004) A4833GMT-ND2同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Onaya et al. (2000) A7472CtRNA Ser (UCN)同质性同质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Hanna et al. (2005

33、) A8296GtRNA Lys同质性同质性/异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Ohsawa et al. (1998) A10398GMT-ND3同质性同质性2型糖尿病型糖尿病Kato et al. (2003) A12026GMT-ND4同质性同质性糖尿病糖尿病Onaya et al. (1998) C12258AtRNA Ser (AGY)异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Turnbull et al. (1998) T14709C*tRNA Glu同质性同质性/异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Moraes et al. (1995) T16189CMT-DLOOP同

34、质性同质性2型糖尿病型糖尿病Poulton et al. (1998) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College57 58 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 59 399bp 307bp 92bp M Un-cut 143B 43B 1 2 RFLP DNA Sequencing DHPLC Control A3243G A3242G WT School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 6

35、0 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 第十六章 肿瘤的分子生物学检验技术 滨医附院检验科滨医附院检验科 袁笑袁笑 常见肿瘤标志物与肿瘤 肿瘤 首选标志物 补充标志物 肺癌 CEA、NSE、CYFRA21-1 TPA、SCC、ACTH、降钙素、TSA 肝癌 AFP AFU、GT、CEA、ALP 乳腺癌 CA15-3、CEA CA549、hCG、降钙素、铁蛋白 胃癌 CA72-4 CEA、CA19-9、CA242 前列腺癌 PSA、f-PSA PAP 结肠直肠癌 CEA CA19-9、CA50 胰腺癌 CA19-9 CA5

36、0、CEA、CA125 卵巢癌 CA125 CEA、hCG、CA19-9 睾丸肿瘤 AFP、hCG 宫颈癌 SCC CA125、CEA、TPA 膀胱癌 无 TPA、CEA 骨髓瘤 本-周蛋白、2-M 常用肿瘤标志物联合检测的临床应用 肿瘤的分子诊断 l肿瘤从本质上来讲是基因出现了问题，本质上 是一种基因病 l同一种肿瘤其驱动基因可能完全不同，对治疗 的反应，肿瘤的发展以及预后可能完全不同 l不同的肿瘤其驱动基因可能相同，对相同的针 对性治疗方案反应相似 因此，针对肿瘤的分子诊断愈发重要 第一节 肿瘤的分子生物学检验策略 一、肿瘤的分子生物学检验策略 l1、检测肿瘤相关基因 l包括癌基因、抑癌基

37、因、肿瘤转移相关基因等。 l2、检测肿瘤相关病毒的基因 l致瘤性DNA病毒：HPV,HBV,EBV等 l致瘤性RNA病毒：人类T细胞白血病/淋巴瘤病毒1和 HCV. l3、检测肿瘤标志物基因或Mrna l在血液中的含量能反应恶性肿瘤的发生发展以及对治 疗的反应 二、肿瘤的分子生物学检验技术 1、标本的来源： 容易获得（无创或微创） 2、分析方法的选择： 敏感性高、特异性强，适合相应样本的检测方法 分析DNA,RNA仍然是分子杂交、PCR、基因测 序。 3、新技术产生：基因芯片，高通量测序，分子 病理学，分子显像技术，高通量质谱技术等。 68 肿瘤分子诊断的常用方法 染色体数目异常：荧光原位杂交

38、技术染色体数目异常：荧光原位杂交技术FISH 致病基因结构异常检测致病基因结构异常检测 （1） 斑点杂交（斑点杂交（dot blot hybridization） （2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（ASO） （3）单链构象多态性（）单链构象多态性（SSCP） （4）限制性内切酶图谱（）限制性内切酶图谱（restriction map）分析）分析 （5）限制性片段长度多态性（）限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP ） （6）DNA 分子杂交（分子杂交（Southern blot）

39、致病基因表达异常检测致病基因表达异常检测 （1） mRNA检测检测 定量定量PCR （2）蛋白检测免疫组化：定性、半定量、定位）蛋白检测免疫组化：定性、半定量、定位Western blot ：定量：定量 第二节 肿瘤诊断的生物标志物 70 肿瘤诊断的生物标志物的发展 第第1 1阶段阶段（1963-19781963-1978）：癌胚性抗原）：癌胚性抗原 l19631963年年 Abelev AFPAbelev AFP l19651965年年 Gold & Freeman CEAGold & Freeman CEA 第第2 2阶段阶段（1979-19891979-1989）：糖链抗原为主）：糖链抗

40、原为主 l19801980年年 Koprowski CA19-9 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-91116-NS-19-9） l19811981年年 Bast CA125 Bast CA125（OC125OC125） 第第3 3阶段阶段（19901990以后）：基因标志以后）：基因标志 l肿瘤基因标志肿瘤基因标志 71 一、肿瘤相关的染色体异常 1、数目异常：某个癌细胞的染色体共104条，包 括许多异常的染色体 72 2. 染色体结构异常 易位、缺失、重复、环状染色体和双着丝粒染色体 例：Ph染色体（费城1号染色体），慢性粒细胞性 白血病（CML） ，9号和22号染色

41、体长臂易位 9号原癌基因abl和22号bcr基因组合成融合基 因增高的酪氨酸激酶活性。 Ph临床意义在于：95的CML都是Ph阳性，可以 作为诊断的依据。有时Ph先于临床症状出现，故 又可用于早期诊断。 73 二、肿瘤相关基因表达异常 原癌基因: sis、VEGF、EGFR、c-myc 抑癌基因: APC、BRCA、p53、Rb 细胞周期调节基因: cyclins、CDKs、CKIs 细胞凋亡相关基因: Bcl-1、p53、bcr-abl 基因组稳定相关基因(DNA修复基因): APE1 肿瘤转移相关基因:nm23、WDNM、sis、p53 1.肿瘤血管生成相关基因: VEGF 、EGFR、p

42、53 （一）原癌基因（一）原癌基因 l普遍存在于人类或其他动物固有的一类基因， 其在生物进化过程中高度稳定，对细胞无害， 而且在控制细胞生长和分化中起重要作用。在 环境致癌因素作用下，原癌基因发生点突变、 易位激活、原癌基因扩增、癌基因甲基化程度 降低被激活成活性形式的癌基因才引起细胞癌 变。 (一)原癌基因点突变(point mutation) 癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发生突变，使 其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，从而获得了转化细胞的活 性 75 (二)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation） 基因重排（rearrangemant）： 有些癌

43、基因从其染色体的正常位置转移到另一染色体的某个位置， 由于调控环境发生变化，导致从相对静止状态变成激活状态，使原癌 基因表达产物显著增加而导致肿瘤的发生 76 (三)原癌基因获得外源启动子而激活 肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的mRNA或翻译产物蛋白 质的含量来表示 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激活原癌基因， 使其表达产物增多 病毒的增强子常位于5端的长末端重复序列(1ong terminal repeat，LTR)内。如果增强子插入到原癌基因的附近或远处，均使之 激活，促使癌基因的表达比正常表达增高几十甚至上百倍 77 (四)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的

44、甲基化(methylation)对阻抑基因的转录具有重要作用 78 （二）抑癌基因（二）抑癌基因 l又称肿瘤抑制基因，为一类可编码对肿瘤形成 起阻抑作用的蛋白质基因，正常情况下抑制细 胞增殖、促进细胞分化。 抑癌基因失活方式： 1）DNA点突变或缺失导致一个等位基 因失活。 2）DNA甲基化和组蛋白去乙酰化抑制 一个等位基因表达。 （三）细胞周期调节基因（三）细胞周期调节基因 l细胞周期：正常连续分裂的细胞从前一次有丝分裂结束到下一次有丝 分裂完成所经历的连续动态过程，也是多阶段多因子参与的精确而有 序的调控过程。 特点：1）单向性：G1 S G2 M 2）阶段性：因某种原因停滞下来，条件好转

45、，进入下一时项 3）检查点：细胞各时项交叉处存在检查点，通过检查点才能进入 下一个时项。 l细胞周期运行的动力主要来自细胞周期蛋白依 赖性激酶，它的活性受细胞周期蛋白和细胞周 期蛋白依赖性激酶抑制剂调控。这些调控方式 相互制约，形成一个复杂的细胞周期分子调控 网络。 1、细胞周期依赖性蛋白激酶CDK1-13 2、细胞周期蛋白CCND1 3、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDK 4、细胞周期检查点Chk1 (三三)细胞周期调节基因细胞周期调节基因 （四）细胞凋亡相关基因（四）细胞凋亡相关基因 l大致分为三组 l1、促进细胞凋亡基因 l2、抑制细胞凋亡基因 l3、细胞凋亡过程中表达的基因 （五）维持

46、细胞基因组稳定相关基因 lDNA修复基因及基因组不稳定性基因 （六）促进和抑制肿瘤转移的相关基 因 （七）肿瘤血管生成相关基因 VEGF(血管内皮生长因子) 84 三、肿瘤相关单核苷酸多态性 1. SNP与肿瘤 肿瘤易感基因、肿瘤药物治疗相关基因 肿瘤个体化诊疗 2. SNP的研究思路 研究对象差异性 研究技术：PCR、芯片 研究难点：样本采集 85 四、肿瘤相关表观遗传异常 （一）表观遗传（一）表观遗传（epigenetics）是指）是指DNA序列不发生变化序列不发生变化， 但但基因表达却发生了可遗传的改变基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除。这种改变是细胞内除 了遗传信息以外的

47、其他可遗传物质发生的改变，且这种改了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改 变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。 （二）分子机制：（二）分子机制：1、基因印记丢失，一对等位基因只表达来、基因印记丢失，一对等位基因只表达来 自亲本一方的等位基因，而与性别无关。自亲本一方的等位基因，而与性别无关。 2、DNA甲基化：例如启动子区域的甲基化：例如启动子区域的CpG岛高甲基化岛高甲基化 所致抑癌基因转录沉默所致抑癌基因转录沉默 3、组蛋白修饰与染色体重塑、组蛋白修饰与染色体重塑 86 五、肿瘤相关miRNA 1、 miRNA与肿瘤 miRNA与肿瘤发生、发

48、展、诊断、治疗、预后 2、miRNA类肿瘤标志物的研究思路 研究对象：实体瘤、细胞、循环血、其他 研究技术：定量PCR、western blot、芯片、免疫组化、 细胞培养（增殖、迁移、浸润）等等 第三节 肿瘤分子生物学检验的临床应用肿瘤分子生物学检验的临床应用 肺癌 肺癌的分子遗传特征 1、细胞色素P450家族，绝大多数的致癌物 包括内源性和外源性都需经过P450转化，研 究最多的CYP1A1 2、谷胱甘肽转移酶（GST）家族,使致癌物 失活 3、NAT2家族，解毒作用 90 肺癌的分子生物学检验 1、EGFR（原癌基因表皮生长因子受体）基因检测 大多数在NSCLC中过表达且是重表皮生长要是

49、治疗靶 标，EGFR是表皮生长因子相关酪氨酸受体家族的 成员，通过与配体的结合，受体同源和异源二聚 体化，从而激活受体内源性的酪氨酸激酶，并引 发下游信号级联反应，主要包括Ras-Raf-MAP激酶 信号通路、P3K-Akt信号通路和STAT通路。这些 信号通路对细胞的增值、分化、迁移和血管生成 有很强的刺激效应。 91 肺癌的分子生物学检验 2、K-ras检测 ras基因，特别是K-ras基因，与肺癌的发生及预 后有 关。有20%-30%的NSCLC患者存在K-ras基因 突变。80%-90%的突变是12密码子G-T引起的，导 致K-ras蛋白组成性活化， NSCLC患者伴随K-ras 突变

50、与预后不良有关， K-ras突变与EGFR突变是 相互排斥的。伴随K-ras突变的NSCLC患者EGFR- TK3药物敏感性较差 92 肺癌的分子生物学检验 3、甲状腺转录因子1（TTF-1） 是一种分子量为38-40的核蛋白，在胎儿肺组织及成人 型肺泡上皮中存在，而在型肺泡上皮中不表 达， TTF-1高表达则EGFR突变率高，是服用EGFR-TK3药物 的优势人群。 93 肺癌的分子生物学检验 4、癌胚抗原（CEA） 表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，用于检测 上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 靶向EGFR的抗肿瘤药物 类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（ EG

51、FR TKI) 作用机制：抑制作用机制：抑制EGFR胞内区胞内区酪氨酸激酶活性，酪氨酸激酶活性， 阻断阻断EGFR信号通路；信号通路； 药物代表：药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替 尼尼（罗氏）。（罗氏）。 类别二：单克隆抗体类别二：单克隆抗体(mAb) 作用机制：与作用机制：与EGFR胞外区胞外区结合，阻断配体与结合，阻断配体与 EGFR的结合；的结合； 药物代表：药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗 氏）氏）。 乳腺癌 乳腺癌基因检测的意义 BRCA1:1990年研究者发现一种直接与遗传性乳腺癌有关 的基因，命名为BRCA1，1

52、994年又发现另外一种与乳腺癌 有关的基因，称为BRCA2。 乳腺癌遗传检测适宜人群 (如果有以下因素，强 烈建议接受乳腺癌BRCA检查) 1、一个或多个直系亲属有乳腺癌史，如母亲或姐妹 2、家族成员里有早发乳腺癌患者，发病年龄早于40 3、家族成员里两代以上出现乳腺癌患者 4、家族成员有双侧乳腺癌患者 5、家族成员里有卵巢癌患者 6、家族成员有男性成员乳腺癌患者 7、一个或多个家族成员携带BRCA基因突变，即遗传检 测阳性 乳腺癌的分子生物学检测乳腺癌的分子生物学检测 l1、c-erb B-2/HER2基因的检测 l是乳腺癌中较常见，易激活的原癌基因c-erb B-2/HER2基因高表达往往

53、生存率低，恶性程 度高 l2、雌激素受体和孕激素受体的检测 lER和PR阳性的乳腺癌可以进行内分泌治疗 肿瘤生物学行为决定乳癌治疗选择 NegativePositive ER / PgRHER-2 NegativePositive 化疗化疗 Avastin 内分泌治疗内分泌治疗 抗抗Her-2治疗治疗 白血病 1、白血病相关基因突变、白血病相关基因突变 l（1）C-KIT基因突变 l（2）FLT3基因突变 l (3) NPM基因突变 l （4）N-ras基因突变 l （5）NOTCH1基因突变 2、白血病相关基因异常表达、白血病相关基因异常表达 l（1）WT1基因异常表达，为抑癌基因的一种，

54、是急性白血病独立的预后因子 l（2）HOX11基因异常表达，此类患者预后较 好，化疗效果佳。 3、白血病融合基因、白血病融合基因 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体 上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物 也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加， 导致慢性粒细胞白血病的发生 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色 体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质 产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增 加，导致慢性粒细胞白血病的发生 104 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到

55、第22对染色 体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质 产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增 加，导致慢性粒细胞白血病的发生 结直肠癌 大肠癌靶向治疗敏感基因EGFR的传导通路 大肠癌靶向治疗敏感性基因检测 K-RASK-RAS基因检测已经成为大肠癌患者治疗基因检测已经成为大肠癌患者治疗 前必做的常规检查，是目前医生了解大肠前必做的常规检查，是目前医生了解大肠 癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法 K-RASK-RAS基因检测可以筛选出对抗基因检测可以筛选出对抗EGFR(EGFR(表皮表皮 生长因子受体生长因子受体) )靶

56、向药物治疗有效的大肠靶向药物治疗有效的大肠 癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从 而达到良好的预后。而达到良好的预后。 早期检测早期检测K-RASK-RAS还可以通过该基因的状态还可以通过该基因的状态 了解到病人的复发转移风险，为将来选择了解到病人的复发转移风险，为将来选择 最佳治疗做好准备。最佳治疗做好准备。 第十七章 药物代谢与毒副作用相关基因 的分子生物学检验技术 滨医附院检验科滨医附院检验科 袁笑袁笑 是药三分毒？ 你你吃错药吃错药啦啦!你你药吃多药吃多啦！啦！ 不合理用药导致严重不良反应 全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用药，而并非死于自然全球

57、死亡患者中，三分之一是由于不合理用药，而并非死于自然 疾病本身。疾病本身。 WHOWHO（联合国世界卫生组织）（联合国世界卫生组织） 美国每年有美国每年有1010万人死于药物不良反应，直接和间接经济损失达万人死于药物不良反应，直接和间接经济损失达120120 亿美元。亿美元。 FDA(FDA(美国食品和药物管理局美国食品和药物管理局) ) 根据药监局和食品药品管理局等机构的统计：根据药监局和食品药品管理局等机构的统计： 1 1、中国每年有、中国每年有50005000万的住院病人，其中至少万的住院病人，其中至少250250万与药物万与药物 不良反应有关，不良反应有关，2020多万人因此而死亡。多

58、万人因此而死亡。 2 2、我国住院病人中有、我国住院病人中有2020是由于不合理用药造成二次住是由于不合理用药造成二次住 院。院。 传统用药的弊端 症状体征及仪器检查症状体征及仪器检查 诊断诊断药物治疗药物治疗 经验处方经验处方 药物治疗药物治疗 A药药 B药药 C药药 D药药 传统经验性用药代价传统经验性用药代价 1 1、耗时多、耗时多 2 2、花费大、花费大 3 3、疗效差、疗效差 4 4、不良反应多、不良反应多 5 5、毒副作用几率大、毒副作用几率大 药物代谢因人而异 生物转化生物转化 肝脏肝脏 药物药物 药物重吸收药物重吸收 代谢产物代谢产物 排泄排泄 药物重吸收药物重吸收 肾脏肾脏

59、药物毒性但有效药物毒性但有效 药物毒性且无效药物毒性且无效 药物无毒性且有效药物无毒性且有效 药物无毒性也无效药物无毒性也无效 同种同量同种同量 药物治疗药物治疗 一种类型的药并不适合所有人一种类型的药并不适合所有人 药物代谢酶药物代谢酶 决定药物反应的因素 体重体重/身高身高 性别性别 老人老人/小孩小孩/孕妇孕妇 病史病史 并发症并发症 环境因素环境因素 遗传因素（基因）遗传因素（基因） 不同人群不同人群 药代动力学药代动力学药效动力学药效动力学 药物疗效和毒性的个体差异药物疗效和毒性的个体差异 基因组基因组 基因变异基因变异( (单核苷酸多态性单核苷酸多态性) ) 药物靶点药物靶点药物转

60、运体药物转运体 药物代谢酶药物代谢酶 约约59%59%的药物不良反应与遗传相关的药物不良反应与遗传相关 基因变异决定药物反应个体差异 决定性因素决定性因素 单核苷酸多态性（SNP） n导致人类遗传易感性的重要因素导致人类遗传易感性的重要因素 n导致人类药物代谢和反应差异的关导致人类药物代谢和反应差异的关 键因素键因素 由单个核苷酸的变异所引起的由单个核苷酸的变异所引起的DNADNA序列多态性序列多态性 第一节 药物代谢酶基因的分子生物学检验 第一节 药物代谢酶药物代谢酶 相代谢酶相代谢酶CYP2D6、2C19、2C9、3A4、3A5等等 相代谢酶相代谢酶 UGT1A1、1A9 TPMT等等 药