蛋白质组学分析确认由Adaphostin诱导的氧化应激资料

1、蛋白质组学分析确认由Adaphostin诱导的氧化应激姓 名：王芳2011 年_2 月 _28_ 日原文出处：Luke H. Stockwin ; Proteomic Analysis Identifies Oxidative Stress Induction byAdaphostin J. Clin Cancer Res. 2007,13(12):3667-81蛋白质组学分析确认由Adaphostin诱导的氧化应激摘要：目的：由于激活的BCR/ABL完全不同于被抑制的BCR/ABL ,使得adaphostin 被描述为”可探寻作用机制的药物”。在这项研究中，adaphostin治疗髓系白血病

2、 细胞株的蛋白质组学分析进一步阐明了其作用机制。实验设计：用adaphostin分别处理 HL60细胞和K562细胞6,12和24小时， 然后用二维电泳分析，取表达差异位点，用胰蛋白酶消化，再用液相色谱串联质 谱分析。利用对苯二酚(1,4苯二酚)或过氧化氢处理的 HL60细胞蛋白质组学 分析氧化还原活性氢醌基团对 adap hostin的作用。结果：adaphostin处理的细胞经过分析发现49个差异表达的蛋白质，其中 大部分是在与氧化应激或诱导细胞凋亡有关。有趣的是，当加入一种抗氧化剂 N-acetylcyste ine，这些蛋白质的调节作用几乎完全被阻止。蛋白质组数据证实 GSTP1可以作

3、为一种adaphostin抗性基因。随后对苯二酚或者双氧水处理过的 HL60细胞分析发现细胞内的过氧化物增加，该结果和经adaphostin处理过的细胞具有相似的蛋白质组学图谱。通过蛋白免疫印迹法鉴定发现超氧化物歧化酶与抗adaphostin有关，通过苯二酚抑制 SOD可增强adaphostin敏感性分析表明 SOD作为adap host in第二抗性基因，然而转染SOD后却会降低毒性。重要的是， 1,4苯二酚或过氧化氢处理后的 adaphostin诱导BCR/ABL多肽降解，这表明激 酶抑制是一种依赖活性氧的现象。结论：Adaphostin应被归类为氧化还原活性物质，可替代对苯二酚。Adap

4、hostin是一个十分有效的抗癌药，但是他的作用机制尚不清楚。作为酪 氨酸磷酸化抑制剂家庭一员，该化合物是一种结构不同的蛋白质酪氨酸酶抑制剂 激酶o Adaphostin最初确定为AG957类似物，一个非竞争性ATP抑制剂p210Bcr/abl 类似物。Adaphostin和AG957对恶性细胞增生的影响与p210bcr/abl多肽降解和快 速诱导细胞凋亡有关。Adaphostin比AG957促进BCR/ABL的体外降解的能力 要高3-4倍，Adaphostin促进BCR / ABL的体外降解能力是 AG957的3 - 4倍， 它能稍微加强 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y

5、l)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide 在细胞毒性试验中的活性，这种机制与ATP依赖的抑制剂BCR/ABL相比，能防止未经磷酸化多肽降解，并且在经过较长时间曝光诱导细胞凋亡。更多的迹象表明两 者的结构不同，adaphostin和STI571可以协同对抗T-淋巴细胞白血病细胞株， 而且adaphostin可以杀死抗STI571细胞，这为它们的结构不同提供了进一步的 证据。在adaphostin显示出具有使白血病和神经胶质瘤细胞系不表达BCR/ABL后，adaphostin对BCR/ABL特异性受到质疑。这导致有人认为adaphostin是一个专一性不强的激酶抑制剂

6、。有报道认为，adaphostin诱导细胞死 亡时伴随着 活性氧 的增加。由于 adaphostin包含一个取代基，具有转移电子产生超氧化物自由基的的能力，从而 提高活性氧的含量。为支持这一假说，对 1,4-对苯二酚的研究就非常重要。另一 种可能的解释来自于最新关于 cDNA列阵的研究，研究表明cDNA能增加与铁 代谢有关的基因转录表达，从而增加ROS的产生。随后有人解释adaphostin能促进铁螯合物释放游离的二价铁，这可能会催化形成有毒的羟基自由基通过反应 H2O2+ Fe2 Fe3+ + OH-。尽管通过实验获得了大量数据，但是几个问题仍然没 有解决，反应中的基本分子还有待确定。例如，

7、ad aphostin已被证明能够抑制分泌血管内皮生长因子，从而有人提议，adaphostin就像其他此类化合物（如SU5416，semaxanib）具有抗血管生成活性。同样，信号转导通路的改变和 adap hosti n对某些恶性肿瘤具有选择性需要进一步关注。在这项研究中，我们采用以二维电泳为基础的蛋白质组学平台来识别 adaphostin的蛋白质调节和作用机制。通过两个adap hostin处理过的髓系白血病细胞系裂解所有细胞，HL60细胞（BCR/ABL阴性）和K562 （BCR/ABL阳性）， 形成了实验基础。结果显示，氧化应激反应和诱导凋亡作用的蛋白质组学分析是 一致的。调节蛋白GS

8、TP1被转染到细胞中去抵抗adaphostirt adaphostin治疗通 过接触到一个简单的对苯二酚或过氧化氢发现蛋白质组学结构基本相同，包含以adaphostin为核心的生物学氧化还原作用机制。这促使我们对抗氧化酶的作用进 一步分析，从而把超氧化物歧化酶I作为抗adaphostin的标记。总之，简单的对 苯二酚和过氧化氢也能 以类似的方式影响的BCR/ABL的多肽降解治疗 adaphostin,这表明抑制酪氨酸激酶的活性是一种间接的事件与增加氧化应激有 关。材料与方法材料：Adaphosti n（ NSC 680410），所有细胞株来自于癌症治疗和诊断肿瘤科 （Frederick, MD

9、）.，PBS和RPMI，质量生物制品；BCA蛋白检测，Pierce;聚偏 氟乙烯膜和所有凝胶，Invitrogen公司；完整的蛋白酶抑制剂药片和 WST试剂， Rocheo主要抗体如下：超氧化物歧化酶的I川，过氧化氢酶，GSTP1和髓过氧 化物酶，单克隆抗体；检测p210Bcr/abl的癌基因,Calbiochem公司；H型肌动蛋白， Sigma公司。二次辣根过氧化物酶标记的抗体 ,Jackson Immu no research;铜/锌超 氧化物歧化酶的表达构造和控制基础 pCMV6- XL5来自Origene技术。除非另有 说明，所有其他化学品和抑制剂为 Sigma公司。细胞毒性和细胞活力

10、取浓度为104 /100卩的细胞置于96个孔板治疗24H，将样品（10 uD添加到 适当的孔板，在37C、湿润、充满CO2的培养箱培养培养2-3小时，在37C下， 把收获的细胞用玻璃纤维过滤器提取细胞，清水洗净，甲醇干燥并计数 测定细胞凋亡和坏死在确定凋亡和坏死细胞比例时，我们采用了 Vybrant细胞凋亡检测试剂盒（分 子探针），数据的采集和使用Cellquest控制的分析流式细胞流式细胞仪（Becton Dickinson 公司）细胞周期分析处理的细胞收集后用PBS洗涤一次，将样品悬浮于 5 mL PBS溶液和滴入 5ml70%的冷乙醇。经过5分钟的培养，将细胞离心，悬浮在10毫升70%冰

11、乙醇， 4C保存1小时，这些细胞用5 mL PBS和PBS的1毫升含50卩g/m碘化丙啶（分子 探针）和100微克卩g/nL核糖核酸酶A （Sigma公司）清洗两次。在37C培养1小时 后，用流式细胞仪的FL3- A通道进行细胞周期分析。免疫印迹法处理后的细胞用PBS洗两次，然后溶解在RIPA-CHAPS buffer，超声裂解，离 心除去不溶 性物质，依据制造商 的指示用BCA蛋白检测蛋白 质的含量。SDS-PAGE用10%的NUPAGE胶进行电泳，每个加样孔10ug蛋白。电泳结束后， 将蛋白电转至PVDF膜上。膜用含4%牛奶的TBS液封闭过夜，然后与1抗孵育2h， 之后用含4%牛奶的TBS

12、液洗涤膜多次，再与酶标二抗孵育 2h。条带用增强化学 发光试剂ECL进行显色。蛋白质羰基的测定。HL60 cells （15x 106 每 30 mL）用 5 卩 mol/ L的 adaphostin或者 100 卩 molL H2O2 培养一段时间。然后用PBS洗涤细胞，加入0.5ml浓度为0.2 mol/L NaPO4，其 中包含1mmol/L的EDTA和蛋白质抑制酶。超声波处理2次，每次10s，然后离 心除去不溶性物质。蛋白浓度测定采用BCA蛋白检测，羰基测定，0.2ml的2mg/ml 蛋白沉淀16%三氯乙酸（终浓度）。球团悬浮于1毫升2 mol / L盐酸（对照组）， 室温下，黑暗环境

13、中孵育30分钟，涡旋每五分钟。然后样品加入16%三氯乙酸（终浓度）冰箱孵育5分钟，然后离心五分钟。沉淀物用乙醇/乙酸乙酯（1:1） 混合液洗涤三次，溶解于0.1毫升6 mol / L的盐酸胍2mol/ L的盐酸。离心5分 钟除去不溶性物。2,4二硝基苯处理的样品与2 mol / L的盐酸处理的样品差光谱 测定结果之间差别在366NM处用22,000（ mol/L ） -1cm-12,4-二硝基苯的摩尔消光 系数谷胱甘肽-S華移酶活性测定。谷胱甘肽-S -转移酶活性测定用分光法测定谷胱甘肽巯基共轭到1 -氯-2,4二硝基苯在340 nm。离心（悬浮细胞）或刮（贴壁细胞）收集细胞，在冰冷的环 境中

14、加入100 mmol / L的磷酸钾其中包含2 mmol / L EDTA和蛋白酶抑制剂超声 10s，离心，消除任何不溶性物质。用 BCA蛋白检测蛋白质浓度。活性氧的检测收集细胞，用PBS洗涤一次，然后使其悬浮在1x106ml/mL的含血清的培养 基中。然后在37C下不同adaphostin浓度中分组培养1H，CM-H2DCFDA （分子 探针），其能与过氧化反应产生的绿色荧光，加入到最终浓度为 10卩mol/L溶液 中培养1H,用PBS洗涤细胞2次，流式细胞仪分析仪上使用 FL1通道。 超氧化物歧化酶I和GSTP1转染。转染细胞进行了使用 Amaxa Nucleofector技术，简言之，用

15、PBS洗涤细胞后， 2x106细胞悬浮于100 Z以备转染，加入2切质粒DNA，与悬浮液混匀，倒入 Amaxa试管，使用适当的电流刺激转染，转染后，把细胞悬浮在完整的培养液 中，装到96孔板，37C培养14小时，然后分别加入不同浓度的adaphostin如上 面所说的。Two-dime nsio nal PAGE向细胞中加入 5卩mol/L （HL60细胞）或者30卩mol/L （K562细胞）adaphostin, 分别培养6,12,24小时。此外HL60细胞还要50卩mol/L的对苯二酚，100卩mol/L H2O2或者adaphostin 10 mmol/ L的L-NAC处理24h，然后

16、用PBS洗涤细胞2次。 使用BCA蛋白检测蛋白质，对于二维凝胶电泳，将21毫升培养细胞裂解在750L 的细胞裂解/补液缓冲区，细胞裂解物超声两次10秒，然后离心除去不溶性物质。 对于第一维电泳，第一维电泳，用裂解/补液缓冲液来将200 g蛋白样本进行调 整到450并用24cm的条。在Ettan IPGphor设备上进行等电聚焦，20C，每 带最大80A，按下列程序：0V下4小时，30v下7小时（补液），200v下1小 时，500v下1小时，1000v下1小时，8000v下8到12小时（等电聚焦），直 到达到60到100Kv-h。经过等电聚焦，凝胶条分别切成三等分块，通过温和的 震荡20分钟使其

17、平衡，每一个溶液包含 50 mmol/L Tris-HCl （PH6.8） 6 mol / L 尿素，30%甘油，2% w/v SDS和一点溴酚蓝。将2% dithioerythritol添加到第一 个平衡步骤中，2.5% w/v碘乙酰胺添加到第二个平衡步骤，对于第二个方面，胶条的NuPAGE被放置在4%至12%羟甲基甲烷凝胶顶部，用0.5%琼脂糖NuPAGE MES SDS的缓冲液密封，200v跑400分钟，然后通过荧光染色法染成红宝石色， 同时用胰蛋白酶消化，水洗，7%醋酸和10%甲醇固定，30分钟，染色过夜。为 了减少背景荧光，凝胶在7%乙酸，10%甲醇中脱色30分钟。凝胶用风级9200

18、 成像仪成像。凝胶切割和胶内蛋白质的胰蛋白酶消化将蛋白质从红宝石染色的胶条上切离到96孔板上，用100 mmol/L甲酸铵碳酸氢盐清洗凝胶点两次。用乙腈对凝胶点进行脱水，在真空离心压缩集中器 SC110A中干燥，用50 mmol / L的碳酸氢铵缓冲液包含12.5卩g/ 的测序级猪胰 蛋白酶使干凝胶点进行再水化 45分钟在冰箱里。等到凝胶点再次膨胀，剩下的 缓冲液用50 mmol / L的碳酸氢铵替代掉，然后37C消化16小时，除去上清液， 先用25 mmol / L的碳酸氢铵提取胰蛋白酶多肽，此后每 20分钟加入5%甲酸。 合并后的提取物，以及消化后上清，在真空离心压缩集中器中风干，然后溶入

19、 10L的1%甲酸，5%的乙腈，然后质谱分析。质谱蛋白质鉴定所使用的技术涉及微毛细管液相色谱串联质谱法。用芬尼根离子阱质谱仪对胰蛋白酶消化的蛋白质样品进行了分析，由此产生的数据文件通过 Mascot进行了分析。结果建立蛋白质组学分析条件.Adaphostin治疗与蛋白质合成的抑制和凋亡诱导 迅速有关。一些检查被用来研究 adaphostin对HL60 （BCR/ABL阴性）和K562（BCR/ABL阳性）细胞的影响，阐明了蛋白质组学的最适合的条件，第一组的 实验测量了 adaphostin对蛋白质合成及细胞活力效果的影响72小时以上。在这两个实验中，adaphostin对HL60和K562细胞

20、取得最大的效果是第一个 24小 时，当adaphostin浓度为50%时，第1、2、3天的浓度分别为 0.35, 0.3, 0.4卩mol/ L，3.5，2.5和3.0卩molL的K562细胞。细胞的IC50值分别是1.0,1.5和 1.5卩mol/LHL6（细胞；10,7和7卩mol/LK562细胞分别在第1、2、3天。在这两个 实验中，BCR/ABL的阴性细胞株，HL60细胞对adaphostin敏感度是BCR/ABL 阳性细胞株K562细胞的5到10倍。在第二组的实验，流式细胞仪是用来监测 的细胞凋亡诱导现象通过使用膜联蛋白 V/碘化丙啶。当HL60和K562细胞的响 应时间为1.0,1

21、0卩mol/ L的膜联蛋白V阳性细胞内adaphostin含量检查显示增加 在4小时后，24小时后大部分的细胞膜联蛋白 V/碘化呈阳性。此外，对 HL60 和K562细胞进行细胞周期分析显示，adaphostin治疗后，亚二倍体细胞DNA含量的百分比增加，这些数据支持上面的结论，即BCR/ABL的表现不一定需要 adaphosti n 的活动。对adaphostin处理细胞进行蛋白质组学分析，为了描述细胞诱导adaphostin蛋白质组变化，对治疗过的HL60和K562细胞的全细胞裂解液进行二维电泳。 一个小型二维凝胶格式，将其24厘米等电聚焦非线性条（pH值3-10）分为三个 8厘米块划分，

22、并用 3个4%至12% Bis-Tris Zoom凝胶，然后准备 Western blot 分析。先分别用0.1, 1和5卩mol/ L adaphostin分别曝光6，12和24小时显示最 佳的反应，根据被调整过的斑点数量来观察，均视为HL60细胞被 5卩mol/Ladaphdim处理。观察到K562细胞在各种浓度下的蛋白质组剖面都没变。 提高adaphostin的浓度到30卩mol/L增加曝光时间12到24h，发现这是对 K562 最佳的。小型凝胶经过复合染色后可以观察到数百个斑点。手动检查染色后的凝胶，记录斑点，只有通过这些斑点才能知道是不是要调整浓度做进一步的分析。凝胶组分析显示ada

23、phostin诱导的HL60细胞产生的60个斑点和K562细胞产生 的59个斑点有一些差别。对 HL60细胞时程分析表明，在6小时的时候大部分 的反应已经发生了： 69%下调蛋白质和86%上调蛋白质已经发现，ad aphostin治疗是一个快速反应。经过12小时，他们分别上调92%和下调100%。上百种 不同的蛋白斑点显示表达趋势和几个参照斑点，切取红宝石色染色的凝胶，用胰 蛋白酶消化，并用纳流喷雾微毛细管液相色谱串联蛋白质质谱鉴定。这项工作最 终鉴定出79个蛋白斑点差异调节。在蛋白质水平，HL60细胞和K562细胞有19个差异，在K562细胞中8个蛋白表达上调，只有1个蛋白下调，而在HL60

24、 细胞中，10个蛋白被调控着上调，这些结果表明，adaphostin治疗诱导的细胞蛋 白质组发生重大的变化。GSTP1 表达抗 adaphostinK562细胞中的抗氧化酶GSTP1上调为抗adaphostin物质的研究提供了一个 提示。调查K562细胞转染的GSTP1表达的增加是否会调节adaphostin活动，正 如预期蛋白质组的结果，对K562细胞的免疫印迹显示GSTP1可以内源性表达， 转染后，当时的GSTP1水平大大提高。这样说明抗 adaphostin性大大增加。在 对HL60细胞尝试相同的转染导致细胞死亡。用 GSTP1转染IGROV1细胞后， 发现其抗adaphostin能力增

25、强。然而，总谷胱甘肽 S -转移酶活性的测定揭示了 生物活性和抗adaphostin性呈正相关。Adaphostin,1,4苯二酚，过氧化氢抑制细胞内蛋白质合成。最近的研究 adaphostin以活性氧作为中心机制引发了一个调查关于对苯二酚，1,4苯二酚或过 氧化氢复制adaphostin某些方面的生物活性的观察。我们通过两种不同的方法来 验证这个假设，在第一个实验中，HL60细胞和K562细胞用不同浓度adaphostin, 1,4苯二酚，或过氧化氢治疗24小时，然后测定其蛋白质的合成。结果表明：每 一组都十分相似，经过处理 K562细胞的耐受性比HL60细胞要强，为了进一步 探讨的活性氧的

26、作用，adaphostin对蛋白质合成是由抗氧化剂 L-NAC决定的。 当L-NAC衰减时，adaphostin对HL60细胞蛋白质合成影响加强 5倍，对K562 细胞的蛋白质合成影响加强2.2倍。在第二个实验中，HL60细胞和K562细胞分 别用adaphostin,对苯二酚，过氧化氢处理 1小时，然后添加CM-H2DCFDA， CM-H2DCFDA与过氧化物反应生成绿色荧光分子。流式细胞仪分析显示，在这 两种细胞系，荧光显着增加随着三种试剂加入。这些实验发现adaphostin和对苯二酚和双氧水具有相似性。Adaphostin提高蛋白质羰基化反应通过 L-NAC阻断 一个过程。为了检验ad

27、aphostin对蛋白质羰基的影响，通过裂解 adaphostin处理 过不同时间的HL60细胞得到裂解液，由一个标准的2,4二硝基苯耦合分光光度测定法检测。结果显示，ad aphostin和阳性对照的时间依赖性增加蛋白质羰基的 最大羰基化，在8小时达到高峰。Adaphostin处理过的细胞蛋白质组剖面与对苯二酚或者过氧化氢处理过的相 似，可以被 L-NAC逆转，为了进一步阐述的作用对苯二酚源性活性氧对 adaphostin作用，HL60细胞通过1,4苯二酚，或者过氧化氢处理，然后通过蛋白 质组学分析对比。此外，抗氧化剂 L-NAC对adaphostin处理过的细胞的影响也 进行了研究发现ad

28、aphostin, 1,4苯二酚或者过氧化氢处理过的细胞曝光后的蛋白 质组学图谱是相似的。同时还通过一些实验发现Cu/Zn超氧化物歧化酶能够抑制adaphostin,而Adaphostin，对苯二酚，过氧化氢的影响酪氨酸激酶p210Bcr/abl降解。要确定是不 是氧化应激单独诱导Bcr/ABL的多肽降解做了如下实验，通过不断加大adaphostin, 1,4苯二酚或者过氧化氢的剂量来培养 K562细胞24小时。结果表明，K562细胞里BCR/ABL的是优先降解相对与 H -肌动蛋白当加入adaphostin ( 3 卩 mOIL)和 1,4, dihyroxybenzene( 30 卩 mo

29、lL)和或过氧化氢( 50 卩 mol/_)。 此外，所有的治疗导致c - Abl抗体反应的高分子聚合的外观。然后对adaphostin, 1,4苯二酚或者过氧化氢使用抗氧化剂发现，抗氧化剂不能恢复 BCR/ABL的表 达。进一步证实凋亡途径是在两行积极来自于程序性细胞死亡的蛋白5。讨论在这项研究中，通过髓系白血病细胞株的蛋白质组学分析，以提供对假定的 抗癌药adaphostin的生物活性的了解。初步实验支持 adaphostin与抑制蛋白质的 合成，氧化应激和诱导细胞凋亡有关。对HL60细胞和K562细胞使用二维电泳的分析表明改变了几个生物途径中几种蛋白质的表达，主要是有关细胞凋亡和氧化应激

30、反应的。关于细胞凋亡，从已知的蛋白酶底物裂解片段，确定了这两个细胞系。同样的，远的上游元件结合蛋白2在原始形状下的下调可能会表现蛋白酶 裂解的一个方面。进一步证实凋亡途径是程序性细胞死亡的蛋白5 ( PDCD5蛋白)检测水平的提高和降低磷酸酶的水平。程序性细胞死亡的蛋白5的表达显著 提高，在细胞凋亡过程中，证明了磷酸酶是细胞生存所必需的。识别更多的HL60 细胞的蛋白酶裂解产物比K562细胞更能为以细胞为基础的蛋白质组学实验和时 间进程的反应提供了依据。这进一步证实了向下过渡是在HL60细胞的内质网ATP酶调解下进行的。内质网 ATP酶通过激活细胞核nB因子途径抗细胞凋亡。与氧化应激反应有关的

31、几种蛋白质同时也在HL60细胞和K562细胞受到调制。这样的一个例子是钙结合蛋白钙调蛋白。活性氧和Ca2+之间存在广泛而复杂的相互作用。氧化应激条件下，钙调蛋白的关键蛋氨酸残基被选择性氧化，允许它来调节多种蛋白激酶和磷酸酶的活性。一个重要的改变途径仅限于HL60细胞有关糖酵解酶aenolase丙酮酸激酶和甘 油三磷酸脱氢酶调节，翻译后修饰的糖酵解酶被认为是细胞内的氧化压力传感 器。在最近的蛋白质组学研究，氧化剂，包括过氧化氢，显示出了羰基化反应和 糖酵解酶包括aenolase丙酮酸激酶和甘油三磷酸脱氢酶诱导的多肽降解。在大 肠埃希氏大肠杆菌的研究中，A -烯醇化酶是H2O2或者O2调节羰基化反

32、应的主 要目标之一。因此，氧化应激的“传感器“正在调制，这反映了的较高水平的活性氧存在于HL60细胞。一些的蛋白质组专门为K562细胞提供分子基础增加抗adaphostin性的相对 HL60细胞。这II型分子伴侣是细胞生存不可或缺的，而K562细胞的增殖细胞核抗原调控可能是一种保护机制。除了 DNA复制的作用，PCNA还参与核苷酸 错配碱基切除修复。增殖细胞核抗原水平的增加可能因此提高K562细胞对细胞DNA损伤造成的压力的承受能力。同样，胁迫诱导蛋白ERp29也是受到K562细胞调控。虽然这个分子伴侣的生物学功能尚不清楚，研究使用ERP29过度表达的大鼠甲状腺细胞株以证明 ERp29会与其他

33、内质网分子伴侣协同蛋白质折叠 和分泌。最引人注目的是一个关于 adaphostin反应修改所涉及的解毒酶 GSTP1, 这个酶是在K562细胞中表达的。这个代谢酶对于保护在氧化应激下的细胞起着 重要作用。GSTP1的转录受到抗氧化剂接收器的控制。GSTP1超表达已被用于抗阿霉素和瘤可宁，而临床上，GSTP1的表达水平增加是一个不好的指标。在此，观察到在GSTP1转染的细胞内adaphostin活性明显减弱，为耐药性提供了 一个有力的证据。同样地，观察到全部谷胱甘肽S -转移酶活性和adaphostin活性之间的关系证明了这类酶家族具有抗 adap hostin性。在结构上，adaphostin

34、由一个氢醌结构和惰性adamantyl集团组成。在碱性条 件下，氢醌被超氧自由基和各自醌氧化，若干报告表明，氢醌的氧化还原活性， 或许可以解释一些由于adaphostin引起的生物现象。有趣的是，在关于对苯代谢 物对HL60细胞影响的研究中，简单的氢醌被确认为有效的活性氧发生器。对苯 二酚处理后发现其可诱导HL60细胞凋亡，并抑制蛋白质的合成和分泌单核细胞 因子。在这里，我们发现，对苯二酚1,4-苯二酚处理后活性氧会快速增加，并发 现，adap host in处理的细胞的蛋白质组学图谱几乎相同。因此，一个合乎逻辑的 想法就比较adaphostin比作一个简单的活性氧发生器，如过氧化氢。HL60

35、细胞对过氧化氢的敏感度为 K562细胞的2倍，反应了这些细胞系对 adaphostin的敏 感性。蛋白质组学分析过氧化氢处理的 HL60细胞发现几乎相同的剖面，这些结 果支持活性氧是由 adaphostin上的苯二酚基团直接产生的效应机制。然而， adaphostin的adamantyl基团的重要性不容忽视，这种惰性非极性基团已经被发 现可以提高几种生物分子膜的透性，这也许可以解释的adaphostin活性增加相对 1,4苯二酚。考虑到对苯二酚氧化能力是与超氧离子的生成有关，我们推测，抗氧化酶特 别是超氧化物歧化酶可能改变 ad aphostin的活性，在这方面，对在不同细胞系的 抗氧化酶进行了研究发现，最终是通过表达Cu/Zn超氧化物歧化酶 I来抗adaphostin,更加有力的证据是转染了超氧化物歧化酶I的细胞产生了抗性，然而用超氧化物歧化酶I抑