微生物技术与应用核心知识

1、微生物技术与应用核心知识第1章绪论微生物技术的概念：所有直接或间接的利用微生物、微生物的机能、微生物的组成部分或其代谢产物（如酶）来加工生产产品，或为社会提供服务的技术。微生物技术的特点：需要多学科的指示，既多学科性质。微生物技术发展趋向：v微生物基因组研究形成巨大推动力v新微生物类群的发现将拓宽其应用领域v生物质资源导向性新经济体制的建立v可持续发展的重要基石 微生物技术的基本原理：具有基础性作用来讲，主要是以下三学科的相关原理：微生物学与分子生物学、发酵工艺学、生化分离理论微生物应用的基本技术可以分为以下几类：微生物分离与纯培养技术、菌种选育技术、培养基制备技术、灭菌技术、大规模发酵与控制

2、技术、产物分离与纯化技术微生物技术的流程一般可以分为三个部分：菌种分离与选育部分；发酵培养部分；产物分离纯化部分。第2章 微生物资源开发与菌株选育第一节 常用微生物的类群一、工业化菌种应符合下述要求：q能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物q有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强q遗传性能要相对稳定q不易感染它种微生物或噬菌体q产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）q生产特性要符合工艺要求二、工业上重要细菌：埃希氏大肠菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、枯草芽孢杆菌、链孢囊菌属、芽孢梭菌、链球菌三、放线

3、菌1概念：放线菌（actinomyces）是指在形态上具有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似，以孢子进行繁殖的原核微生物。放线菌实际上是属于细菌范畴内的原核微生物，只不过其细胞形态为分枝状菌丝。2放线菌对人类最突出的贡献：就是它能产生大量的、种类繁多的抗生素，目前已经发现的抗生素有近6000种，其中4000多种是由放线菌产生的（其中90%由链霉菌产生）。3工业上重要放线菌属：链霉菌属、诺卡氏菌属、小单胞菌属、链孢囊菌属四、真核微生物凡是细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的微小生物，都称为真核微生物。1真菌：具有细胞壁，不含叶绿素，无根茎叶的分化，以产生大量孢

4、子进行繁殖，以寄生或腐生方式生存的真核微生物。2工业上重要真菌：酵母菌、霉菌、蕈菌五、极端微生物极端微生物（extremophiles），也叫极端环境微生物，是最适合生活在极端环境中的微生物的总称，包括嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜碱、嗜压、嗜盐、抗辐射、耐干燥和极端厌氧等多种类型嗜热菌的最著名的产品：taq酶第二节 菌株的分离与筛选一、新种分离与筛选的一般步骤：1定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性，设计合理的筛选方案。2采样：有针对性地采集样品。3增殖（富集）：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。4分离：利用分离技术得到纯种。5生产性能测定：进行生产性能测

5、定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适ph值、提取工艺等。二、样品采集：采样对象土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，但总体来讲土壤样品的含菌量最多。 采样季节以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式在选好适当地点后，除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。三、增殖（富集）：富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。富集培养的方法：1控制培养基的营养成分：不同种类的微生物，对营养的成分的

6、需求不同，在培养基中添加要分离的目的菌容易利用而其他杂菌不易利用的成分，目的菌因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能利用这些物质，生长受到抑制。2 控制培养条件：在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对ph、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.07.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.56）。因此，富集培养基的ph值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。分离放线菌时，可将样品液在40恒温预处理20分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌数目，达到富

7、集的目的。3抑制不需要的菌类：通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100很难杀死，要在121才能彻底死亡。可先将土样加热到80或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性无抑制作用。筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所需的菌株。分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制g+菌）、链霉素（抑制g-菌）各3050

8、u/ml，以及丙酸钠10g/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。四、分离方法分离是指采用一定的方法，将采集的含菌样品分散接种到分离培养基上，以获得单个的菌落。1 常用的分离方法：水悬浮稀释法、干土喷射法、孢子飞扬法。2水悬浮稀释法：又称湿法分离，是最常用的一种分离土壤微生物的方法。具体方法是：取风干并破碎的土样1g，加如无菌水10ml，剧烈震摇1min，然后静置1min，使粗砂粒沉淀，吸取上面的悬浮液1ml，用无菌水进行系列梯度稀释，取适当浓度的稀释液0.1-0.2ml，涂布于分离平板上培养。干土喷射法：又称干法分离。该法是用一种特制的喷土器将研碎的干土样直接喷射到分离平板上，根据土样的多

9、少、喷射距离的远近以及喷射角度来调节每个平板的喷射量。孢子飞扬法：是将土样置于一种瓶口刚好能倒扣一个分离平版的特制瓶中，距离振荡使孢子飞扬，撞在分离平板上，进行分离培养。该法可分离到许多放线菌。某些细菌的富集条件五、生产性能测定确认获得纯的单一菌落后，进行代谢产物的筛选（如产酶、抗生素等），将分离到的符合筛选目标的菌株保藏、鉴定。高通量筛选与自动化：高通量筛选技术（high throughput screening，hts），是将各种模型固定在微孔板（96孔甚至384孔），进行自动稀释、加样，并用机器人读结果，用计算机记录、计算、整理分析实验结果，使筛选从繁重的劳动中解放出来，实现了筛选的快速

10、、准确、微量、重现性高和大规模化。高通量筛选技术的关键是建立一种微量、灵敏、可自动化操控的筛选模型。以热稳定蛋白酶产生菌筛选为例：将选出的菌落接液体试管进行微量培养，以对硝基苯胺短肽衍生物为反应底物，在96孔板中65下反应10min和40min，分别用微孔读板仪测定酶活，然后用两种酶活的比值作图来代表酶的热稳定性，选出热稳定性高的菌株。第三节 菌种改良一、菌种改良的方法：自然选育、诱变育种、杂交育种和基因工程育种。（一）自然选育：在生产过程中，未经人工诱变或杂交处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。自然状态下，碱基对发生自然突

11、变的机率仅为10-810-9，出现优良性状的可能较小，需坚持相当长的时间才能收到效果。（二）诱变育种：诱变育种是指用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（dna）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的突变菌株的一种育种方法。 诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、突变率高、突变谱广的优点，它不仅能提高产量，改进质量，还可扩大产品品种和简化工艺条件，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变育种的不足是缺乏定向性。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。物理诱变剂中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中

12、小型工厂都适用，也很安全。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气诱变剂物理诱变剂：紫外线、x-射线、-射线，快中子等化学诱变剂烷化剂：ems、des、ntg碱基类似物：5-溴尿嘧啶其他诱变剂：亚硝酸、羟胺生物诱变剂：转座因子（三）诱变育种的一般步骤：诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。1.出发菌株的选择出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力。要尽量选择单倍体细胞、单核

13、或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。2.诱变处理 （1）诱变剂的选择：在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如ntg。 （2）诱变处理方式单一因子处理复合因子处理：两种以上因素先后使用、同时使用或单一因子重复使用 3.突变株筛选菌种经诱变处理后，会产生各种各样的突变类型，需要选择一定的筛选方式，将具有所需性状的突变株筛选出来。实际工作中，

14、为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。突变株的常用筛选方法：a菌体形态变异分析：有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。b平皿快速检测法：是利用菌体在

15、特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，可以大大提高筛选的效率。c摇瓶培养法：是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。特殊变异菌株的筛选方法：特殊变异菌株，如营养缺陷型、抗性突变菌株、温度敏感突变株、组成型突变株等。营养缺陷型或抗性突变等的性状就象一个高效分离的“筛子”，以它们

16、为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。在现代的育种中，常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在dna中设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。（四）杂交育种：不同基因型的品系或种属间，通过交配或体细胞融合等手段形成杂种，或者是通过转化和转导形成重组体，再从这些杂种或重组体或是它们的后代中筛选优良菌种。这种育种方法称为杂交育种。通过这种方法可以分离到具有新的基因组合的重组体，也可以选出由于具有杂种优势而生长旺盛、生物量多、适应性强以及某些酶活性提高的新品系。杂交育种的方式因实验菌株的生殖方式不同而异，如有性杂交、准性重组、原生质体融合、转化、转导、杂种质粒的转化等

17、；但是，选择亲株、分离群体后代的培养、择优去劣和杂种遗传分析的过程基本是相同的。1杂交法：一般指有交配反应的菌株进行交配或接合而形成杂种。这种方法适用范围很广，在酒类、面包、药用和饲料酵母的育种，链霉菌和青霉菌抗生素产量的提高，曲霉的酶活性增强等方面均已获得成功。2原生质体融合：是最近几十年发展起来的基因重组技术，通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合而达到杂交目的。此法在工业微生物的菌种改良中有积极作用，已成为工业微生物育种的重要手段。原生质体融合育种技术原生质体（protoplast）：采用一定方法技术去掉细胞壁，剩下的细胞部分称之为原生质体。原生质体融合（protoplast fusio

18、n）：用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体相互接触、融合，经染色体交换、重组而达到杂交目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子（fusant）。原生质体融合育种的优点：杂交频率较高 链霉菌通过原生质体融合，后代的重组率达1%，比准性重组率高20-20000倍。扩大重组的亲本范围 原生质体由于完全或部分去除了细胞壁，能实现常规杂交无法做到的种间、属间、门间等远缘杂交。提高菌株产量的潜力较大 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状机会更大。原生质体融合育种步骤：1标记菌株的筛选和稳定性验证。2原生质体制备。3等量原生质体加

19、聚乙二醇促进融合。4涂布于再生培养基，再生出菌落。5选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6生产性能筛选。（五）基因工程育种：是指利用dna重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或表达前者的基因产物而获得新种。 基因工程育种的特点：q打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制 q可进行定向变异和育种 q可创造出自然界中原本没有的生物 基因工程育种的基本步骤： 1、目的基因的获得选择目的基因的途径有4种：选择适宜的给体细胞,以便从中采集分离到有生产意义的目的基因；通过反转录酶的作用由mrna合成cdna(互补dna)；通过聚合酶链反应（pcr），以基

20、因组dna或cdna模板扩增得到目的基因片段；用化学方法合成特定功能的基因。2、选择载体载体（vector）是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。载体必须具备下列几个条件:是一个有自我复制能力的复制子;能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率；最好只有一个限制性内切酶的切口,使目的基因能固定地整合到载体dna的一定位置上；载体上必须有一种选择性遗传标记，如具有四环素、氨苄青霉素等的抗性基因,以便及时把极少数“工程菌”选择出来。3、目的基因与载体连接获得目的dna片段和载体dna片段后，要把两者连接起来形成重组体。目的基因与载体dna均采用限制性内切酶处理，然后在dna连接酶催

21、化下，两条双链dna片段相邻的5-磷酸和3-羟基间形成磷酸二酯键，形成一个完整的有复制能力的环状重组体。 在分子克隆中最有用的的dna连接酶是来自t4噬菌体的dna 连接酶。4、重组dna分子导入宿主菌体外连接的重组dna分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组dna分子导入受体可有不同的方法。转化：指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容易接受外源dna的状态，然后利用短暂热休克使dna导入细菌宿主中。 此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。转染和感染

22、：利用噬菌体dna作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体dna包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在dna连接酶作用下使噬菌体dna环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体dna为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。5、阳性重组子的筛选、鉴定长出的菌落不一定都是含有正确目的dna片段的阳性重组子，因此需要从转化细菌菌落中筛选、鉴定出含有阳性重组子的菌落。鉴定的方法有直接筛选法和分子生物学间接筛选法。前者利用可选择的遗传表型和功能如抗药性、蓝白斑、噬菌斑等可以直观、快速的在大量群体中进行筛选；后者根据目的基因的大小、核苷酸序列

23、、基因表达产物的特性，用限制性酶切、分子杂交、核苷酸序列分析及表达产物分析。第3章 发酵工艺第一节 微生物发酵的一般流程发酵概念：利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质产物分离纯化成品灭菌发酵类别：v根据对氧的需要区分：厌氧和有氧发酵v根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵v根据微生物生长特性区分：分批发酵和连续发酵发酵的一般流程(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制；(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌；(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发

24、酵罐中；(4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物；(5)将产物抽提并进行提纯，以得到合格的产品；(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水。培养基的配制 1.培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长、繁殖所需的一组营养物质和原料。2.发酵培养基的作用：满足菌体的生长促进产物的形成3.发酵培养基的成分及来源 （1）碳源作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；提供合成目的产物所必须的碳成分。 来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃工业上常用的糖类： 葡萄糖：所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应； 糖蜜：糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制

25、糖工业的 副产物。 糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。 淀粉、糊精缺点：难利用；发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶；成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格底；难利用，可以解除葡萄糖效应。注：不同碳源对微生物自身生长、发酵过程及产物会产生不同的影响。（2）氮源作用：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 无机氮源无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性

26、物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。有机氮源成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。氮源使用的一些相关问题：q有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质q有些产物会受氮源的诱导和阻遏q有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力q开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题（3）无机盐的微量元素使用注意点：a.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑；b、使用时注意盐的形式（ph的变化）（4）生长

27、因子、前体和产物促进剂生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。产物促进剂：是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 （5）水水源质量的主要考虑参数包括ph值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 4.发酵培养基的要求 培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源

28、丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。培养基与发酵设备的灭菌1杂菌：除生产菌以外的任何微生物。2污染：感染杂菌的培养或发酵体系。3培养基灭菌：是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。4灭菌与消毒的区别灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子，杀灭率99.999999%以上。消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物，达到无害化程度，杀灭率99.9%以上。 5灭菌的

29、方法、原理（1）化学灭菌：用化学物质杀灭微生物的灭菌操作。化学灭菌剂：氧化剂类等，卤化物类，有机化合物等。机理：蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。应用：皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及空间的灭菌。（2）物理灭菌：各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌。种类：紫外线等射线：局部空间 干热灭菌：实验室器皿 蒸汽灭菌：培养基效果好，操作方便，广泛使用。（3）蒸汽灭菌的原理：每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在

30、很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。 致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。微生物浓度与灭菌时间成正比，浓度越高，灭菌时间越长。培养基灭菌工艺 (1)分批灭菌操作，间歇灭菌,实罐灭菌：配制好培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度。特点：不需其他的附属设备，操作简便，手动。缺点：

31、加热和冷却时间较长。营养成分损失较多，罐利用率低。适合小批量生产规模。（2）连续灭菌操作：高温短时灭菌操作，培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。 加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由不同的设备执行：加热器，保温设备，冷却器。连续灭菌的特点1）高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；2）热能利用合理，易于自动化控制3）不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌；4）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。5）对压力要求高，一般为0.45-0.8 mpa。空气除菌工艺1、发酵对空气的要求2、工业制备大量空气的方法加热灭菌：利用空气压缩时所产生的热

32、量除菌，无菌化程度不高的发酵过程。静电除菌：通过高压电流场，带电粒子被吸附。介质过滤：捕集粒子及各种微生物。发酵工业采用。3、空气除菌原理v空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5um。v离心场作用：颗粒及其微生物沉降v直接被截留：颗粒惯性碰撞，相互集聚成大颗粒。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。v静电引力：有一定作用。4、空气过滤介质5、空气灭菌工艺过程补料液的灭菌发酵罐的灭菌种子扩大培养定义：种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一.种子扩大培

33、养的任务和培养类型1.任务：2.培养类型3.种子扩大培养阶段的培养方法： 液体培养法：液体试管、三角瓶摇床震荡或转式培养； 表面法培养：液体表层，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。 固态法培养：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。4.种子的要求：5.种子制备的过程分为：实验室阶段：生产车间阶段：二.影响种子质量的主要因素1.培养基2.培养条件： 温度 ph值 通气搅拌 泡沫3.染菌的控制4.种子罐级数 发酵控制影响发酵的因素很多，如温度、ph、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。控制参数：1温度 2

34、ph值 3氧 4.通风和搅拌 5.种龄与接种量 6.co27.基质浓度8.补料方式9.泡沫10.发酵终点的确定发酵中判断放罐的大要指标：有产物浓度、过滤速度、氨基氮、菌丝形态、ph、发酵液的外观及黏度等；一般菌丝自溶前总有迹象，如氨基氮开始升高、ph上升、菌丝碎片增多、黏度增加、过滤速度降低等，其中最后一项对染菌罐尤为重要。发酵过程的放大将实验室和中试车间试验所取得的研究结果应用到大规模的工业生产中的过程称之为放大(scale up)。发酵工艺的放大，一般要经过实验室、中间工厂(或称中试车间)和生产工厂3个步骤。2 微生物摇瓶与发酵罐培养的差异及发酵罐规模改变的影响2.1 摇瓶与罐培养的差异摇

35、瓶与罐培养的差异可能有以下3个方面：(1)体积氧传递系数(k l)和溶解氧的差异微生物发酵多数是需氧发酵，而表示氧溶入培养液速度大小的溶氧系数k d值，随摇瓶发酵与罐发酵、摇瓶装料系数不同而不同。发酵罐中的k d值一般都大于摇瓶。由于k d值不同，使各自培养液中溶解氧的浓度也不同、因而对菌体代谢会产生重要的影响。特别是对溶氧要求高而又敏感的菌株，在罐中发酵的生产能力可能比在摇瓶中高，并随k l和溶解氧水平升高而升高。(2)co2浓度的差异发酵液中的co2既可以随空气进入，又可以是菌体代谢产生的废气，co2在水中的溶解度随外界压力的增大而增加。发酵罐发酵是处于正压状态，而摇瓶基本上处于常压状态，

36、所以罐中培养液的co2浓度明显大于摇瓶，而co2对细胞呼吸和某些微生物代谢产物的生物合成有着较大的影响。(3)菌丝受机械损伤的差异摇瓶培养时，菌体只受液体的冲击或沿着瓶壁滑动的影响，机械损伤很小。而采用罐发酵时、菌体，特别是丝状菌，却因受到搅拌叶的剪切力而损伤，其受损程度远远大于摇瓶发酵。菌体受伤导致核酸物质的漏失，进而影响菌体代谢。2.2 发酵罐规模改变的影响发酵罐规模的变化，导致很多物理和生物参数的改变。改变的主要参数有菌体繁殖代数、种子的形成、培养基的灭菌、通气和搅拌，以及热传递等3 放大的方法 从小规模的操作条件到大规模的放大过程，主要以单位体积输入功率相等和保持k l值不变为基础进行

37、。第二节 工业发酵的方式一、分批发酵1、 分批发酵定义：是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了空气、消泡剂及控制ph的酸或碱外，培养基中接入菌种以后，没有物料等任何其它物质的加入和取出。微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期。对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。分批发酵的优缺点优点：操作简单，周期短，不会产生菌种老化和变异等问题，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。缺点：非生产时间较长、设备利用率低，产率低，不适于测定动力学数据。二、补料-分批发酵 定义：又称半连续发酵或流加分批发酵，是

38、指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。补料分批发酵的优点:在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺；和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题。 补料分批发酵的缺点由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降;存在一定的非生产时间；由于有物料的加入增加了染菌机

39、会。三、连续发酵1.定义：培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的ph、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。2.连续发酵的优点：能维持低基质浓度；控制稀释速率可以使发酵过程最优化，提高设备利用率和单位时间的产量；发酵周期长，得到高的产量；便于自动控制。3.连续发酵的缺点：菌种发生变异的可能性较大；长时间补料染菌机会大大增加，要求严格的无菌条件。4.连续发酵的类型（1）恒化培养：使培养基中限制性基质的浓度保持恒定；（2）恒浊培养：使培养基中菌体的浓度保持恒定。四、固态发酵1.

40、定义：是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。从生物反应过程的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程，而液态发酵是以液相为连续相的生物反应过程。从这个定义中可以充分认识固态发酵的特点，以及与液态发酵本质的区别。 2.固态发酵的特点固态发酵是气体作为生物反应过程中的o2、co2、热量、营养和产物的传递介质，表现为o2、co2扩散比较容易，热量传递困难，存在明显的营养梯度，并且无大量有机废水产生。3.固态发酵与液态发酵比较分析本质区别是以气相还是以液相为连续相的差异，具体表现是固体发酵基质中游离水的多少。 固态发酵中微生

41、物生长在缺乏或几乎不可见液体水的颗粒之间，在固态发酵系统中，微生物可以从湿的基质颗粒中获得所需的水分。4.固态发酵的分类 （1）传统固态发酵与现代固态发酵 依据固态发酵过程中是否能实现限定微生物纯种培养，分为传统固态发酵与现代固态发酵。（2）固态发酵的形式 固态发酵可分为自然富集固态发酵、强化微生物混合固态发酵、限定微生物混合固态发酵和单菌固态纯种发酵。自然富集固态发酵：是指利用自然界中的微生物，由不断演替的微生物进行的富集混合发酵过程。典型的例子是传统酒曲和酱油、腌莱、烟草发酵、茶叶发酵、青贮、堆肥等。强化微生物混合固态发酵：是指在自然富集固态发酵的基础上，根据人们部分掌握的微生物代谢机制，

42、人为强化接种微生物菌系不明确的富集培养物或特定微生物培养物所进行的混合发酵过程。 强化微生物混合固态发酵除应用于沼气发酵、白酒发酵作用外，在石油采收、湿法冶金、食品发酵等领域同样显示其优势。 限定微生物混合固态发酵：是在对微生物相互作用和群落认识的基础上，接种混合培养的微生物是已知和确定的，通常使用两种或两种以上经过分离纯化的微生物纯种，同时或先后接种同一灭过菌的培养基中，在无污染条件下进行的固态发酵过程。 目前对于具有协同作用关系的菌株筛选和组合还是一个随机过程的，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混合培养体系也不能有效地协调菌间的关系，使其达最佳生态水平，发挥最大效应。这严重地阻碍了混

43、合菌培养的发展和应用。 单菌固态纯种发酵：是在纯培养基础上建立起来的，对于选育良种、保持生理活性和代谢过程中的稳定起很大作用。它对于扩大固态发酵的应用范围和潜力的发挥起到非常重要作用，同时，也是固态发酵一个重要方向。 五、固定化酶和固定化细胞发酵什么是固定化酶 ？固定化酶的优缺点优点：多次使用、可以装塔连续反应、纯化简单、提高产物质量、应用范围广缺点：酶在固定化中易失活、首次投入成本高、大分子底物较困难制备固定化酶的方法（一）微型胶囊法：是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。（二）吸附法1物理吸附法优点：

44、固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱，易解吸附。2.离子结合法酶分子 + 含有离子交换基团的固相载体 第一个离子结合法固定化酶：deae cellulose固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶：deae-sephadex a-50固定化氨基酰化酶（三）胶格包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。（四）共价交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。（五）共价偶联法：利用酶表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将酶固定。 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共

45、价偶联酶分子区别：（a）共价交联：酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）共价偶联：酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶固定化细胞一、定义：是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。 1.与游离细胞相比，固定化细胞发酵优点：2.与固定化酶相比，固定化细胞优点：三、固定化细胞的缺点虽然固定化细胞具有上述许多优点，但也有不足之处，具体表现在：1.仅能利用胞内酶；2.细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；3.载体形成的孔隙大小

46、影响高分子底物的通透性；4.可能有副反应。四、固定化细胞的分类1.按固定的细胞类型不同分为三类：微生物、动物、植物。2.按细胞的生理状态不同分为两大类：（1）死细胞：包括完整细胞、细胞碎片、细胞器。适用于一种酶催化的反应。（2）活细胞：包括增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞。适用于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。五、细胞固定化的方法细胞固定化方法有：吸附、共价结合、交联、包埋、微胶囊。 六、固定化方法的比较吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。包埋法：细胞和载

47、体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。 第三节 基因工程菌的发酵何谓基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 工程菌的获得工程菌应具备的条件工程菌的应用：1.基因药物2.其它发酵产品利用基因工程菌生产的特点v基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多

48、，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。v基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。基因工程菌生长与表达的影响因素1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。2、ph值对工程菌生长和表达的影响在相同通气量和搅拌速度下，ph值对不同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有一定影响。偏碱性的ph对外源蛋白的表达不利，因此，表达开始要调节ph在6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。3、诱导时间对外源蛋白表达的影响

49、诱导时间：加入诱导剂后的培养时间 随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。4、生长速率占优势的不稳定性如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么改变了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。 5、乙酸对生长和表达的影响第四章 微生物发酵产物的分离与纯化第一节 分离纯化策略一、建立分离纯化工艺的根据1.微生物发酵产物的特点2.原理（1）物理性质（2）化学性质（3）生物学性质二、分离纯化的基本过程1.一般工艺过程一般说来，分离纯化的基本过程可分为4个阶段：培养液(发酵液)的预处理和固液分离、初步纯化(提

50、取)、高度纯化(精制)、成品加工。 2.工艺过程的划分： 发酵的下游加工过程可以下过程： （1）预处理和固液分离 ：目的是分离菌体和其他悬浮颗粒；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 （2）初步分离 ：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后来精制工序创造有利条件。 （3）高度纯化 ：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。 （4）成品制作 ：成品形式由产品的最终用途决定。 三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化1 收率与纯度之间的平衡2 经济性考虑3 工艺放大4 纯化过程中对产品的检测在线检测：在工艺运行过程中，通过对在制品取样并用适当仪器和方法检测试样品相应指标、或

51、通过安装在生产设备上的检测仪器（如感应探头等）直接检测加工物料或设备的有关数据，以了解工艺运行状况，并对其进行调整和控制。 数据检测：纯化工程中往往在进一步加工前需要测试在制品的某些指标的具体数值，根据测得的数据进行计算，确定下一道工序的工艺参数后才继续加工，这种检测即为数据检测。放行检测：在一道纯化工序结束后，其产物是否可以进入下一道工序继续进行分离纯化处理，应根据加工工艺的要求，对工序车间在制品设定质量标准，抽样检验在制品有关质量指标，其结果符合标准后方允许在制品进入后一道工序继续加工，这种检测就是放行检测。第二节 分离纯化技术一、细胞破碎技术（一）发酵液的预处理和固液分离目的 方法：高价

52、无机离子的去除方法，杂蛋白质的去除，发酵液的凝聚和絮凝。 1.高价无机离子的去除方法 （1）钙离子，可用草酸。草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液(也称为原液)质量。（2）镁离子，可用三聚磷酸钠和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。（3）铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。2.杂蛋白质的去除方法（1）热变性（2）沉淀（3）大幅度改变ph3.发酵液的凝聚和絮凝 （1）凝聚和絮凝的概念，过去常常混淆，现已趋于明确区分开来，区别：凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的

53、降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。（2）方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。（3）常用的絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠。（二）微生物细胞的破碎 微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢

54、产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 1. 微生物细胞的破碎技术 常见的细胞破碎方法有：机械方法（珠磨法、高压匀浆器、x-press法、超声波破碎）和非机械方法（酶解法、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法）常见的细胞破碎方法分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目标产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声波破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作x-press固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感的目标产物不适应非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶解酶价格高，适用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具有一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，适用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其它方法结合使用冻融法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感的目标产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活化学法细胞溶解或组分外渗容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题2.破碎方法的选择二、沉淀分离纯化技术 定义：利用沉淀剂使所需提取的生化物