临床基因扩增检验质量保证1

1、质量保证质量保证 (Quality Assurance,QA) l为一产品或服务满足特定质量为一产品或服务满足特定质量 要求提供充分要求提供充分可信性可信性所必要的所必要的 有计划的和系统的措施有计划的和系统的措施。 室内质量控制（室内质量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念的概念 l由由实验室工作人员实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，采取一定的方法和步骤， 连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在 监测和控制本实验室工作的精密度监测和控制本实验室工作的精密度，提高本，提高本 室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，室常

2、规工作中批内、批间样本检验的一致性， 以以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的确定测定结果是否可靠、可否发出报告的 一项工作一项工作。 l可概括为可概括为: :(1)(1)执行者执行者：实验室技术人员；：实验室技术人员；(2)(2) 目的目的：监测实验室测定的重复性；：监测实验室测定的重复性；(3)(3)功能功能： 决定了当批测定的有效性，报告可否发出。决定了当批测定的有效性，报告可否发出。 是对实验室测定的是对实验室测定的即时性评价即时性评价。 室间质量评价（室间质量评价（External Quality Assessment, EQA） l为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由为客观

3、比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位外单位 机构机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果， 发现误差并校正结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有使各实验室之间的结果具有可比性可比性。 这这是对实验室操作和实验方法的是对实验室操作和实验方法的回顾性评价回顾性评价，而不是用来，而不是用来 决定在实时的测定结果的可接受性。当决定在实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业许用来为执业许 可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实实 验室能力验证（验室能力验证（Prof

4、iciency testing, PT）。在以前的文献。在以前的文献 中，中，EQA常描述室间质量控制。常描述室间质量控制。 批批 (Run) l在相同条件下所获得的一组测定。在相同条件下所获得的一组测定。 定 义 l正态分布正态分布(Gaussian distribution) 当一 质控物用同一方法在不同的时间重复多 次测定，当测定数据足够多时，如以横 轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中 相应测定值的个数，则可得到一个两头 低，中间高，中为所有测定值的均值， 左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分 布，又称高斯分布。 正态分布 的基本统 计学含义 可用均数 （X）、标 准差（s） 和概率来 说

5、明。 临床基因扩增检验实验室 常规测定步骤 l标本收集：标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。 l实验室测定：实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、 核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗 价值。 l报告和解释：报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。 质量保证、室内质控和室间质评之间的关系 临床标本收集、运送、保存临床标本收集、运送、保存 及其质量控制及其质量控制 l标本收集标本收集 l标本保存标本保存 l标本运送标本运送 标本收集 l标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集时间对扩增检测结果的影响 l标本采集部位的准备标本采集部位的准备 l标本的类型和采集量标本的类型和采集量 l

6、采样质量的评价采样质量的评价 l采样及运输容器采样及运输容器 l标本采集中的防污染标本采集中的防污染 标本采集时间对扩增检测结果 的影响 l在疾病发展过程中，标本采集过早或过在疾病发展过程中，标本采集过早或过 晚都可能会给出假阴性结果。晚都可能会给出假阴性结果。 标本采集部位的准备 l血液标本采集血液标本采集 l分泌物标本分泌物标本: :采集部位的清洁消毒采集部位的清洁消毒 可去掉污染的微生物或其它杂物可去掉污染的微生物或其它杂物, , 但应适度但应适度, ,过度清洁消毒有可能会过度清洁消毒有可能会 去掉或破坏靶微生物去掉或破坏靶微生物, ,故标本采集故标本采集 部位的准备应由训练有素的人员部

7、位的准备应由训练有素的人员 进行进行。 标本的类型和采集量 l标本的类型标本的类型: : 血清血清( (浆浆) )、分泌物、痰、分泌物、痰、 粪便、尿和脑脊液等。粪便、尿和脑脊液等。 l标本的采集量标本的采集量: :应根据所测病原体而定。应根据所测病原体而定。 一般来说，如果标本的量对病原体培一般来说，如果标本的量对病原体培 养够用的话，则其量亦足以用于核酸养够用的话，则其量亦足以用于核酸 提取及其后的扩增检测。提取及其后的扩增检测。 l对于定量测定来说，对标本的收集要对于定量测定来说，对标本的收集要 求更为精确。求更为精确。 采样质量的评价 l血清血清( (浆浆) )标本标本: :溶血、脂血

8、等；溶血、脂血等； l分泌物、痰：评价内容包括细胞组成，分泌物、痰：评价内容包括细胞组成， 所需类型细胞的数量和核酸总量。所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法：包括肉眼观察评价方法：包括肉眼观察, ,显微镜下观察显微镜下观察 和化学分析等。和化学分析等。 采样及运输容器 l标本的采集材料如棉签应为一次性使标本的采集材料如棉签应为一次性使 用；用； l采样及运输容器应为密闭的一次性无采样及运输容器应为密闭的一次性无 菌装置；菌装置； l采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试 剂材料不应对核酸扩增及检测过程造剂材料不应对核酸扩增及检测过程造 成干扰。成干扰。 标本采集

9、中的防污染标本采集中的防污染 l采集中要特别注意污染，防止混入采集中要特别注意污染，防止混入 操作者的头发、表皮细胞、痰液等；操作者的头发、表皮细胞、痰液等； l 如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌， 以使可能存在的以使可能存在的RNase失活。失活。 标本保存标本保存 l靶核酸靶核酸(尤其是尤其是RNA)易受核酸酶易受核酸酶 的作用而迅速降解，因此标本的的作用而迅速降解，因此标本的 保存对于核酸扩增测定的有效性保存对于核酸扩增测定的有效性 极为重要。极为重要。 l使用使用GITC作为稳定剂保存标本，作为稳定剂保存标本， 标本可在室温下稳定约标本可在室温下稳定约7天

10、。天。 标本保存标本保存 l临床体液标本长期保存应在-70下。 l如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样 本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)缓冲液中4 下保存。 l用于RNA扩增分析的样本，则应于上述 缓冲液中-80或液氮下保存。 l核酸的乙醇沉淀物则可于-20下保存。 标本运送标本运送 l样本一经采集，则应尽可能快的送至检样本一经采集，则应尽可能快的送至检 测实验室。测实验室。 l样本中如加入了适当的稳定剂样本中如加入了适当的稳定剂,如用于如用于 RNA测定加入测定加入GITC的血清的血清(浆浆)样本和用样本和用 于于DNA测定的测定的EDTA抗

11、凝血等抗凝血等,则可在室则可在室 温下运送或邮寄。温下运送或邮寄。 l实验室应根据待测靶核酸的特性，对各实验室应根据待测靶核酸的特性，对各 种临床样本的运送条件作出相应的规定种临床样本的运送条件作出相应的规定。 临床基因扩增检验的室内质量控制临床基因扩增检验的室内质量控制 l测定前的质量控制测定前的质量控制 l核酸样本的制备及其质量控制核酸样本的制备及其质量控制 l统计学质量控制统计学质量控制 l质量控制的评价质量控制的评价 测定前质量控制 l实验室设施、仪器设备及管理实验室设施、仪器设备及管理 l理想的试剂和操作方法理想的试剂和操作方法 l人员培训人员培训 实验室设施、仪器设备及管理 l临床

12、基因扩增检验实验室应有充分合理临床基因扩增检验实验室应有充分合理 的空间、良好的照明和空调设备的空间、良好的照明和空调设备 ； l实验室仪器设备应保养良好，实验用品实验室仪器设备应保养良好，实验用品 要达到相应的要求。要达到相应的要求。加样器的校准？带加样器的校准？带 滤塞吸头的使用及质检？离心机？热循滤塞吸头的使用及质检？离心机？热循 环仪？水浴箱和环仪？水浴箱和/ /或恒温干浴仪？酶标或恒温干浴仪？酶标 仪和洗板机？仪和洗板机？ 理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计A 产物分析区产物分析区 空气流向空气流向 空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间缓

13、冲间缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊工作流向工作流向 扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区 产物分析区产物分析区 空气流向空气流向 空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊工作流向工作流向 扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区 理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计B 核酸扩增检测实验室设计的一般原则核酸扩增检测实验室设计的一般原则 l各区独立 l注意风向 l因地制宜 l方便工作 “十六字口诀十六字口诀” 门门 试剂准备区试剂准备区 标本制备区标本制备区 扩增区扩增区 产物分析区产物分析区

14、外走廊外走廊 门门 门门 门门 门门 试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区 扩 增 及 产 物扩 增 及 产 物 分析区分析区 外走廊外走廊 门门 门门 门门 门门 A B 试剂准备区试剂准备区 标本制备区标本制备区 扩 增 及 产扩 增 及 产 物分析区物分析区 门门 门门 门门 门门 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 走廊走廊走廊走廊 试剂准备区试剂准备区 标本制备区标本制备区 扩增和产扩增和产 物分析区物分析区 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室 其他实验室其他实验室其他实验室其他实验

15、室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室 门 试剂准备区试剂准备区 标本制备区标本制备区 扩 增 及 产扩 增 及 产 物分析区物分析区 门 门 门 空气流向空气流向 空气流向空气流向+ 空气流向空气流向+ 走廊走廊 试 剂 准 备试 剂 准 备 区区 标 本 制 备标 本 制 备 区区 扩增和产扩增和产 物分析区物分析区 空气流向 空气流向+ 空气流向+ 其他实验室其他实验室其他实验室 其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室 空气流向 产物分析区产物分析区 空气流向空气流向 空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊工作流向工

16、作流向 扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区 传递窗传递窗传递窗 “无基因无基因”或或“无核酸无核酸”概念的重要性概念的重要性 基因扩增仪器设备的质控基因扩增仪器设备的质控 仪器设备仪器设备质控方法质控方法 频频 度度失控标准失控标准 扩增仪仪器校验实验当仪器移动时实验失败 热电偶监测温度 扩增功能检测 每月一次 每 4 个月一次 如靶温度或温度 差异超出允许范 围 待测孔未出现扩 增，检测温度 程序打印每次测定时打印程序不对 加样器校准每年 2 次不符合要求 水浴箱温度检测每次实验不符合要求 酶标仪预防性维护 及校准 每年 2 次不符合要求 带滤芯吸头的使用及质检带滤芯吸头的

17、使用及质检 l首先制备一个含12%甘油及色素 （如甲基橙）的水溶液，如果吸头 的最大体积为100l，则将加样器吸 取体积调至110120l，再套上吸 头后吸取上述有色液体。如果吸头 质量好，则有色液体不应出现在滤 芯之上，否则说明滤芯不严。 核酸提取用离心管质检 l离心管离心管PCR抑制物质检抑制物质检 l其他其他 扩增仪孔间温度的重复性和均一性 的检测方法 l一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录 仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温 度变异超出1时，其可测出来。 l具体做法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管 放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插 至

18、缓冲液中，然后按程序进行一个常规的PCR扩增，加 热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温 度，在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同 孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增 周期。 扩增仪孔间温度的重复性和均一性 的检测方法 l第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过 扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有 一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反 应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测， 观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个 孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否 会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明 相应孔的热传导有损坏。 理想的试剂和操作方法理想

19、的试剂和操作方法 l试剂盒的质检 l定量测定的精密度是测定组成步骤的变 异和的平方根(SD)= 上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等 （例如试剂准备、标本采集、核酸提取、 扩增和产物检测等）的标准差 SDSDSD abc 222 . 理想的试剂和操作方法 l改善测定精密度的措施必须首先 着重在最不精密的步骤上，应对 试剂准备、标本收集、核酸提取、 测定方法和仪器操作写出“标准 操作程序”(SOP) 实验室质量管理体系的建立 l质量手册质量手册 l质量体系程序文件质量体系程序文件 l标准操作程序标准操作程序(SOP) (相关记录表格、报相关记录表格、报 告告) 存在问题存在问题 lSO

20、P：形式，缺乏可操作性 l记录：检查型。多而杂。 l质控：形式或没有 l分析：缺乏。 实验室质量管理的内涵实验室质量管理的内涵 l写你所应做的 l做你所写的 l记录你已做的 l分析你已做的 l看得见的 l看不见的 l好习惯是生产力 l习惯即命运 l思维习惯与行为习惯 l罗马不是一天建成的 (Rome was not built in a day ) 质量体系文件的三大特性质量体系文件的三大特性 l法规性、唯一性和适用性。法规性、唯一性和适用性。 l法规性法规性:是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真 执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面 所说的做你所写的。并且文件的修改不能随

21、意，只能按规 定的程序进行。 l唯一性唯一性:则是指（1）一个实验室只能有一个质量体系文件 系统；（2）一项检验活动只能有唯一的操作程序；（3） 一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；（4）只能使 用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能 使用。 l适用性适用性:是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎 么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有 文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。 当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件 进行修改。 SOP等于试剂盒说明书吗等于试剂盒说明书吗？ 怎样编写 SOP？ XXX单位 XXX实验室 XXX 标准操作程序

22、编号： 启用日期： 版本： 第 页 共 页 一目的： 二适用范围： 三职责或责任人： 四（方法原理） 五（检测设备和试剂） 六（所需的环境条件） 七操作步骤： 1 2 3 五、本操作程序变动程序： 六、相关的文件 七、相关的记录表格和报告 编写人审核人批准人 SOP （5W和和1H） l谁来做(Who)： 责任人责任人 l做什么(What)：适用范围适用范围 l何时（When）：适用范围适用范围 l何地（Where）：适用范围适用范围 l为什么做（Why）：目的目的 l如何做（How）：操作步骤操作步骤 实验记录表格的设计实验记录表格的设计 存在问题存在问题 l表格种类繁多 l重复记录 l表格

23、无实用性，用于检查的痕迹很重 记录表格设计的基本原则记录表格设计的基本原则 l信息充分 l简单明了 l临床标本的检测信息能有机联系起来 l融入LIS系统？ 临床临床PCRPCR检验流程记录表检验流程记录表 检验日期检验日期 检验项目：检验项目： 扩增仪中保存文件名：扩增仪中保存文件名： 使用说明：使用说明： 1本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。 2各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。 3本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。 实验前准备实验前准备 试剂在有效期内 扩增仪、加样器和温度计在校准的有效

24、期内 生物安全柜的滤膜在使用有效期内 消毒溶液在有效期内 洗眼器内无菌生理盐水在有效期内 离心管、带滤芯吸头已经过质检合格 操作者操作者： 试剂准备区（试剂准备区（1 1区）区） 实验前实验前 ： 打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭） 冰箱温度：冷藏室（28） ； 冷冻室（182） 实验室温度： （允许范围：1030）；相对湿度： （允许范围：30%80%） PCR试剂来源： （可直接列出有关厂家名称） 批号：XXXXXXX 检验项目： 本次实验用量： 人份，剩余量： 人份。 其他有关试剂配制： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制1%含氯消毒液 毫升； 按XXX（将有关SO

25、P编号列出）SOP配制4NaOH溶液 毫升； 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯 毫升； 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制 毫升； 其他： 仪器设备使用：仪器设备使用： 离心机： 正常 不正常 振荡器： 正常 不正常 超净台： 正常 不正常 实验后：实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机， 并进行紫外照射30分钟以上。 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。 操作者：操作者： 标本制备区（标本制备区（2 2区）区） 实验前：实验前： 打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭） 冰箱（柜）温

26、度：冷藏室（28） ； 冷冻室（182） 实验室温度： （允许范围：1030）；相对湿度： （允许范围：30%70%） 阳性室内质控物来源： 浓度及批号： 扩增位置： 阴性室内质控物来源： 批号： 扩增位置： 所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置： 1 19 917172525 3333414149 2 2101018182626 3434424250 3 3111119192727 3535434351 4 4121220202828 3636444452 5 5131321212929 3737454553 6 614142

27、2223030 383846 54 7 7151523233131393947 55 8 8161624243232404048 56 核酸提取及加样过程核酸提取及加样过程：按XXX（列出编号）SOP进行。 仪器设备使用：仪器设备使用： 生物安全柜： 正常 不正常 恒温仪温度校准： 离心机： 正常 不正常 振荡器： 正常 不正常 实验后：实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。 操作者：操作者： 扩增及产物分析区（扩增及产物分析区（3 3区）区） 实验前实验前 打开通风设备 实验台面清洁（水或70%

28、酒精擦拭） 实验室温度： （允许范围：1030）；相对湿度： （允许范围： 30%70%） 扩增仪操作： 开机自检及运行正常 按XXX（列出编号）SOP进行编程、参数 设定 标准曲线计算值：标准曲线计算值：Slope值值： （ ）Intercept值值： （ ） r值值： （ ） 室内质控结果：室内质控结果：结果： 填写室内质控记录、描质控图 是否失控：是否失控：否 是 实验结果：实验结果：见所附扩增仪打印结果 实验后：实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。 操作者：操作者： 失控原因及分析：（失

29、控判断标准及原因分析按XXXSOP进行） 另外两个存在较多问题的档案记录另外两个存在较多问题的档案记录 l人员的技术档案：一人一个档案（包括个人基本情况； 学历、学位、任职资格、培训证、上岗证、荣誉证书 等的复印件；论文、著作、成果等的目录和必要的证 明文件复印件；培训考核的记录等。） l仪器设备的技术档案：一台仪器一个档案（包括仪器 基本情况，如仪器设备名称、型号、序列号、生产厂 家、购置日期、启用日期、目前放置地点、责任人等； 仪器校准的记录（本次校准日期和下次应校准的日期、 校准证书或数据）；维修维护的历史记录；仪器使用 说明书、注册证等的复印件；合格证书；配备的小配 件如保险丝、灯泡等

30、） 人员培训 l方法原理 l核酸扩增检测的关键环节 l仪器设备使用、维护和校准 l结果的分析、报告及进一步处理 l质控的分析 l知其然又知其所以然知其然又知其所以然。 实验室人员内部培训的重要性实验室人员内部培训的重要性 l外部培训提供的是“理念”，是被动的，更多 的是“学习” l内部培训是主动的，源于实践，高于实践，更 多的是“思考” 人员培训人员培训 基本的工作基本的工作 需要需要 仪器设备使用、维护和 校准 知识更新 基本实验技能 分析所做分析所做 的的 工作程序不到位？ 仪器设备操作、维护、校准？ 人员操作？ 质控方法？ 患者或医生患者或医生 投诉投诉 结果解释错误？ 与临床沟通不够？

31、 检测程序、仪器设备有 问题？ 质控问题？ 如何培训的举例：新购仪器设备如何培训的举例：新购仪器设备 的操作培训的操作培训 l在仪器购买合同中，加入培训的内容：厂家提 供培训计划 l培训计划应包括：培训教材（含具体培训内容， 如仪器操作及维护校准的SOP、安全性）、培 训者资质证明、培训所需时间与次数、需要接 受培训方准备的条件（人员、用具和场地等）、 培训合格的考核方法及判断标准等。 l培训后保存所有有关记录。 核酸样本的制备、扩增检测核酸样本的制备、扩增检测 及其质量控制及其质量控制 l一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的 原理 l核酸的分离纯化 l靶核酸提取的质量 l临床标本及核酸提

32、取中可能存在的抑制和干扰 物质 l核酸样本制备及扩增检测的质控 l产物检测的质控 核酸的分离纯化 l核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂 类等干扰核酸扩增的物质去除。 l经典方法 l硅吸附法 l对于商品核酸提取试剂盒，临床实 验室在使用前，必须对其核酸提取 纯度和效率进行评价。 临床标本及核酸提取中可能存在 的抑制和干扰物质 l临床标本中：临床标本中：血清或血浆中的血红素及 其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成 份 、降解靶核酸的核酸酶等。 l核酸提取中：核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸 (EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS) 和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍 等、酚、氯仿、乙醇

33、等有机溶剂 。 对临床标本中可能存在的 抑制/干扰物的质控措施 l质控措施：质控措施： 采用内质控采用内质控 （internal control, IC）（通常）（通常 称为内标）的方法称为内标）的方法 l内标有两种内标有两种,即竞争性的和非竞即竞争性的和非竞 争性的内标。争性的内标。 核酸提取及扩增有效性的质控核酸提取及扩增有效性的质控 l已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相 同）：同）：至少带1份，其最后的检测结果，应 是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反 映。 l已知阴性质控样本（基质与待测标本相已知阴性质控样本（基质与待测标本相 同）：同）：至少带1

34、份，扩增测定的结果可以判 断核酸提取过程中是否发生污染。 室内质控方法室内质控方法 l非统计学方法 l统计质控方法 非统计学方法非统计学方法 l在检测血液标本的同时，检测一定数量（与临 床样本的数量相适应）的已知弱阳性（与试剂 宣称的测定下限相适应）和阴性的质控样本 l检测有效的质控判断方法：阳性检测为阳性 （反应性），阴性检测为阴性（非反应性）。 统计学质量控制 l理想的室内质控样本的条件 l测定中质控样本的设置、数量及 排列顺序 l统计学质控的特点 l统计质控方法 理想的室内质控样本的条件 l基质与待测样本一致； l所含待测物浓度接近试验的决定性水平； l稳定； l靶值或预期结果已定； l

35、无已知的生物传染危险性； l单批可大量获得； l价廉 测定中质控样本的设置、数量及排 列顺序 l标本量不大，如少于30份，定性测定有1份接近 cut-off的弱阳性和1份阴性质控样本应可以满足要 求。样本量大，则可按比例增加。 l定量测定则要根据试验的测定范围，采用高、中、 低三种浓度的质控样本。 l核酸提取时，质控样本要随机放在临床标本中间。 l至于在测定中的排列顺序，可排于标准品或校准品 之后，临床样本之前。 临床基因扩增检验室内质控的 独特性 l即监测污染发生的阴性质控的设 置。 l可包括1份阴性原血清样本、1份 在标本核酸提取过程中带入的一 个空管和仅含扩增反应混合液的 管。 阴性原血

36、清质控样本的功能阴性原血清质控样本的功能 l监测实验室的以前扩增产物的污 染； l由实验操作所致的标本间的交叉 污染； l扩增反应试剂的污染。 在标本核酸提取过程中 带入的一个空管的功能 l监测实验操作过程中的实验室污 染和标本间交叉污染. l不能取代原血清阴性样本。 仅含扩增反应混合液的管的功能仅含扩增反应混合液的管的功能 l监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染 鉴别性。 实验室是否发生污染的鉴别实验室是否发生污染的鉴别 l可将一个或多个空管打开静置于标本制备区 3060分钟，然后加入扩增反应混合液同时以 水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含 扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以

37、 前扩增产物的存在。 统计学质控的特点 l检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。 l系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是 由操作者所使用的仪器设备、试剂、标准品或校 准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述 的措施方法加以控制，是可以排除的。 l随机误差则表现为测定SD的增大，主要是由实 验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以 完全避免和控制。 统计学质控的功能 l统计学质控的功能就是发现误差的产生 及分析误差产生的原因，采取措施予以 避免。 l开展统计质量控制前，应将可以控制的 误差产生因素尽可能地加以控制，这不 但是做好室内质控的前提，也是保证常 规检验工作质量的先决条件

38、。 统计质控方法 l基线测定 l质控规则的表达方式及定义 lLevey-Jennings质控图方法 lLevey-Jennings质控图结合Westgard多 规则质控方法 l累积和 (CUSUM) 质控方法 l“即刻法”质控方法 基线测定 l最佳条件下的变异（Optimal conditions variance, OCV）和常规条件下的变异 （Routine conditions variance, RCV）； l当RCV与OCV接近，或小于2 OCV时，则 RCV是可以接受的。以上为批间变异。 l批内变异的测定； l室内质控物的测定准确度的评价。 临床基因扩增检验IQC统计 计算问题 l

39、可使用质控样本扩增后的IU/ml来 进行统计计算，也可用其对数值进 行。 l由于基因扩增结果的原始数据通常 很大，故使用其对数值来进行质控 统计分析可能要更为方便一些。 质控规则的表达方式及定义 l质控规则的表达方式 l质控规则的功能 l常用质控规则的符号及定义 质控规则的表达方式质控规则的表达方式 l通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超 出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均 值或均值13SD来表示。 l当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失 控。 l常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中 的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值 中

40、，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批 测定判为失控。 质控规则的功能 l简单地说就是用于判断测定 批的失控还是在控 。 常用质控规则的符号及定义 符符 号号 定定 义义 l12S 一个质控测定值超出2s控制限。 l13S 一个质控测定值超出3s控制限。 l22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。 lR4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。 l41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。 l7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。 l10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（X）的同一侧。 Levey-J

41、ennings质控图方法质控图方法 l也称Shewhart质控图，是由美国的 Shewhart 于1924年首先提出，并用于工 业产品的质量控制。 l二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将 其引入临床检验的质量控制 。经Henry和 Segalove的改良，即为目前常用的Levey- Jennings质控图。 Levey-Jennings质控图 Levey-Jennings质控图质控图 基本的统计学含义基本的统计学含义 l稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1 个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在 1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限） 的结果不多于3个。

42、 l如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。 “假阳性假阳性”的统计学室内质控方的统计学室内质控方 法法 l基于日常检验的阳性率比值(呈正态 分布) l直接概率计算方法（不呈正态分布） “即刻”质控方法 l“即刻法” 的实质是一种统计学 方法,即Grubs异常值取舍法 l只要有3个以上的数据即可决定 是否有异常值的存在。 室内质控数据的评价 lIQC为一集体活动，除实际测定者外，还应有 另外一人对测定数据进行质检。 l不能将IQC作为一个监察方法，当发现一次测 定未达到质量标准时，应以建设性的而非批评 的方式去探查失控的原因。 l除了将IQC数据作为日常质控外，还应定期评 价累积数据以监测在

43、测定操作中的长期变化趋 势。 l评价应定期进行。 分析你已做的分析你已做的 l每次实验结果的分析 表象与真象 l多次实验结果的综合分析 趋势的内在含义 l仪器设备的使用情况分析 维护与校准周期的有效性 弱阳性质控样本常见的失控原因 l核酸提取中的随机误差。核酸提取中的随机误差。如核酸提 取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、 标本中扩增抑制物的残留等。 l仪器的问题。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的 不均一性、孔内温度与所示温度的不 一致性等。 l试剂的问题。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶 的失活、探针的纯度及标记效率和核 酸提取试剂的效率等。 阳性质控样本测定结果偏低或为阴性阳性质控样本测定

44、结果偏低或为阴性 结果偏低结果偏低阴性阴性 临床标本中临床标本中 无强阳性无强阳性 临床标本中临床标本中 有较强阳性有较强阳性 临床标本临床标本 中有阳性中有阳性 临床标本临床标本 全为阴性全为阴性 观察临床标本情况观察临床标本情况 所用离所用离 心管含心管含 抑制物抑制物 Taq酶酶 活性降活性降 低低 核酸提核酸提 取试剂取试剂 效率低效率低 更换进更换进 口离心口离心 管管 更换更换 Taq酶酶 再检测再检测 更换核更换核 酸提取酸提取 试剂试剂 所有标本重新检测所有标本重新检测 核酸提核酸提 取中靶取中靶 核酸丢核酸丢 失失 核酸提核酸提 取中抑取中抑 抑物残抑物残 留留 核酸提核酸提

45、 取试剂取试剂 混入混入 扩增仪扩增仪 孔间温孔间温 度差异度差异 随机误差 检测质控样本及检测质控样本及35份已份已 知阳性样本知阳性样本 质控样本质控样本 测定正常测定正常 且阳性样且阳性样 本有些值本有些值 增加增加 质控及已质控及已 知阳性样知阳性样 本测定仍本测定仍 异常异常 按系统误按系统误 差途径分差途径分 析析 重新提取或已知浓度重新提取或已知浓度DNA 在同一孔内扩增在同一孔内扩增 结果正常结果正常结果仍低结果仍低 进行扩增进行扩增 仪孔温度仪孔温度 校准后再校准后再 检测检测 Taq酶或酶或 逆转录酶逆转录酶 失活失活 阴性质控样本的失控原因阴性质控样本的失控原因 l主要为

46、扩增产物的主要为扩增产物的“污染污染”和和/ / 或临床标本的核酸提取过程中发或临床标本的核酸提取过程中发 生的标本间的交叉生的标本间的交叉 “ “污染污染” 阴性质控样本测定为阳性阴性质控样本测定为阳性 临床标本亦全为阳性临床标本亦全为阳性临床标本中有阳性也有阴性临床标本中有阳性也有阴性 扩 增 产 物扩 增 产 物 “污染污染” 试剂试剂“污染污染” 同时检测的标本情况同时检测的标本情况 扩 增 产 物 轻扩 增 产 物 轻 度度“污染污染” 标 本 间 交 叉标 本 间 交 叉 “污染污染” 35空管室空管室 内静置内静置 58份水样份水样 本检测本检测 试剂直接试剂直接 扩增检测扩增检

47、测 验证验证验证验证 58份水份水 样本检测样本检测 暂停日常检验，实暂停日常检验，实 验室清洁、通风验室清洁、通风 更换试剂更换试剂 措施措施 有阳性，则确认有阳性，则确认 有实验室有实验室“污染污染” 无阳性，说明为无阳性，说明为 标本交叉标本交叉“污染污染” 改善操作改善操作 措施措施 一个临床一个临床PCR实验室对全实验室对全 年室内质控结果的分析举例年室内质控结果的分析举例 IQC的局限性 lIQCIQC可能测不出的误差可能测不出的误差 l 测定前测定前 测定中测定中 测定后测定后 样本鉴定不对样本鉴定不对 样本吸取不对样本吸取不对 结果记录错误结果记录错误 样本贮存中变质样本贮存中

48、变质 试剂加入不对试剂加入不对 l此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一 般要求小于般要求小于 0.1%0.1%，且应均衡地分布于测定前、测，且应均衡地分布于测定前、测 定中和测定后的不同阶段。定中和测定后的不同阶段。 影响临床基因扩增检验结果 的最关键因素 l产物“污染”（Carry-over) l测定人员的操作：标本混淆；贴错 标签、核酸提取等 l试剂 避免基因扩增检验假阳性结果的措施 l严格的实验室分区； l使用带“滤芯”的吸头； l设立“阴性”质控（与标本同时处理）； l使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂； l临床“假阳性”问题：病原微

49、生物如结核 杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳 性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检 测。 避免基因扩增检验假阴性结果的措施 l避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些 激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的 抑制作用的措施：（1）纯化核酸；（2）标本 重复双份测定；（3）稀释标本。 l使用“内质控”（Internal Control,IC)以避免由 于试剂、扩增仪或标本处理不当所致的假阴性； 须注意的是，如果靶浓度很高，可致在靶核酸 和IC之间产生竞争，而使IC受抑制，此时IC可 为阴性。 室间质量评价（室间质量评价（EQA） lEQA lProficiency testing

50、(PT) EQA 的程序设计的程序设计 l确定质评方案,定期发放质评样本； l要求参加质评实验室报告结果的单位要一致， 以便于统计； l报告要清楚、简洁； l要求参评实验室在测定EQA样本时，要以与常 规样本完全相同的方式测定； l对测定方法、试剂及仪器等归纳总结； l对参评实验室的测定要有评价； lEQA报告要迅速及时。 EQA质评样本质评样本 l样本特征与患者样本应尽量一致 l样本浓度与试验的临床应用相适应 l在样本发放的条件下稳定 l不存在不可避免的传染危险性 EQA靶值靶值 l定性测定，应为明确的阴性或阳性 l定量测定，则提供参考方法值或参 加实验室的修正均值或参考实验室 均值或方法或归组的方法均值 评价方法 l特定参评实验室的评分根据其与其它实验室得分之 间的关系，可分为绝对评分和相对评分两种模式。 l绝对评分就是根据已定的靶值对参评实验室测定的 每份质评样本计分，然后再计算该次质评的总分， 以得分的高低评价参评实验室的水平。 l相对评分则是将参评实验室质评得分与所有参评实 验室的平均分进行比较，