第四讲免疫血清学技术

1、免疫血清学技术免疫血清学技术 用于检测抗原或抗体的体外用于检测抗原或抗体的体外 免疫反应技术或称免疫检测免疫反应技术或称免疫检测 技术，这一类技术因一般都技术，这一类技术因一般都 需用血清进行试验，通常称需用血清进行试验，通常称 为免疫血清学反应或免疫血为免疫血清学反应或免疫血 清学技术清学技术 第 四 讲 一、凝聚性试验一、凝聚性试验 v抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质 存在下，相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或存在下，相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或 沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定相应抗沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定相应抗 体或抗原，称

2、为凝聚性试验体或抗原，称为凝聚性试验 v根据参与反应的抗原性质不同，分为由根据参与反应的抗原性质不同，分为由颗粒性颗粒性 抗原参与的抗原参与的凝集试验凝集试验和由和由可溶性可溶性抗原参与的抗原参与的沉沉 淀试验淀试验二大类二大类 （一）凝集试验（一）凝集试验 v细菌、红细胞等细菌、红细胞等颗粒性抗原颗粒性抗原，与相应抗体结，与相应抗体结 合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，合，在有适当电解质存在下，经过一定时间， 形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验 (agglutination test)。 v参与凝集试验的抗体主要为参与凝集试验的抗体主要为IgG、I

3、gM。 v凝集试验可用于检测抗原或抗体。凝集试验可用于检测抗原或抗体。 v凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式 分为分为直接凝集试验直接凝集试验（简称凝集试验）和（简称凝集试验）和间间 接凝集试验接凝集试验。 直接凝集试验 v颗粒性抗原颗粒性抗原与与凝集素凝集素直接结合并出现凝集直接结合并出现凝集 现象的试验称作直接凝集试验现象的试验称作直接凝集试验(direct agglutination test) v玻片法：定性试验，适用于新分离细菌的玻片法：定性试验，适用于新分离细菌的 鉴定或分型鉴定或分型 v试管法：定量试验，检测待测血清中是否试管法：定量试验，检

4、测待测血清中是否 存在相应抗体和测定抗体含量存在相应抗体和测定抗体含量 间接凝集试验 v将将可溶性抗原可溶性抗原(或抗体或抗体)先吸附于一种与免疫先吸附于一种与免疫 无关的，一定大小的无关的，一定大小的不溶性颗粒不溶性颗粒(统称为统称为载载 体颗粒体颗粒)的表面，然后与相应抗体的表面，然后与相应抗体(或抗原或抗原)作作 用，在有电解质存在的适宜条件下，所出用，在有电解质存在的适宜条件下，所出 现的特异性凝集反应称为间接凝集反应。现的特异性凝集反应称为间接凝集反应。 v敏感性高，但特异性较差敏感性高，但特异性较差 可溶性抗原 v细菌、立克次氏体及病毒的可溶性抗原细菌、立克次氏体及病毒的可溶性抗原

5、 v原虫、吸虫、丝虫的浸出液原虫、吸虫、丝虫的浸出液 v动物的可溶性物质动物的可溶性物质 v激素及各种组织器官浸出液激素及各种组织器官浸出液 v植物性蛋白质如花粉浸出液等植物性蛋白质如花粉浸出液等 v某些细菌的可溶性多糖某些细菌的可溶性多糖 常用的载体颗粒 v有有红细胞红细胞(“O”型人红细胞，羊红型人红细胞，羊红 细胞细胞)、聚苯乙烯胶乳颗粒，、聚苯乙烯胶乳颗粒， v白陶土、离子交换树脂、火棉胶白陶土、离子交换树脂、火棉胶 v致敏颗粒：载体吸附了可溶性抗原致敏颗粒：载体吸附了可溶性抗原 间接血凝试验 将抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，将抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体， 在与相

6、应抗体反应时出现肉眼可见凝集，称为在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集，称为间间 接血凝试验接血凝试验(passive heamagglutination assay, PHA) 将抗体致敏于红细胞表面，用以检测检样本中相将抗体致敏于红细胞表面，用以检测检样本中相 应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝 集，称为集，称为反向间接血凝试验反向间接血凝试验(reverse passive heamagglutination assay, RPHA)。 乳胶凝集试验 聚苯乙烯乳胶是利用化工原料聚苯乙稀经过乳液聚合聚苯乙烯乳胶是利用化工原料聚苯乙稀经过乳液聚

7、合 得到的高分子乳胶液，乳胶微球直径约得到的高分子乳胶液，乳胶微球直径约0.8 m。 对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸附性能。对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸附性能。 利用聚苯乙烯乳胶的微球作载体，以吸附某些抗原利用聚苯乙烯乳胶的微球作载体，以吸附某些抗原(或或 抗体抗体)，即能用以检测相应的抗体，即能用以检测相应的抗体(或抗原或抗原)，称为乳胶，称为乳胶 凝集反应。凝集反应。(latex agglutination test) 协同凝集试验 v葡萄球菌葡萄球菌A蛋白蛋白(staphylococal protein A，简称简称SPA)是是 大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能

8、与多种大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种 哺乳动物哺乳动物IgG分子的分子的Fc片结合。片结合。 vSPA与与IgG结合后，其结合后，其Fab片暴露于外，并保持其抗体片暴露于外，并保持其抗体 活性。活性。 v当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合 时，就可互相连结引起协同凝集反应，简称时，就可互相连结引起协同凝集反应，简称COAG。 （二）沉淀试验 v可溶性抗原可溶性抗原(如如细菌细菌的外毒素、内毒素、菌的外毒素、内毒素、菌 体裂解液，体裂解液，病毒病毒的可溶性抗原、血清、组的可溶性抗原、血清、组 织浸出液等织浸出液等)与相应抗

9、体结合，在适量电解与相应抗体结合，在适量电解 质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称 为沉淀试验为沉淀试验(precipitation test)。 v抗原可以是抗原可以是多糖、蛋白质、类脂多糖、蛋白质、类脂等，抗原分等，抗原分 子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结 合的总面积大，故在作定量试验时，为了不合的总面积大，故在作定量试验时，为了不 使过剩，使过剩，通常稀释抗原通常稀释抗原，并以抗原稀释度作，并以抗原稀释度作 为沉淀试验效价。为沉淀试验效价。 v参加沉淀试验的抗原称参加沉淀试验的抗原称沉淀原沉淀原，抗体称为，抗

10、体称为沉沉 淀素淀素。 环状沉淀试验 v在小口径试管内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁在小口径试管内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁 加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层 v数分钟后，两层液面交界处出现数分钟后，两层液面交界处出现，即为，即为 阳性反应。阳性反应。 v本法主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断本法主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断 ()。试验时出现白色沉淀带的最高抗原稀释。试验时出现白色沉淀带的最高抗原稀释 倍数，即为血清的沉淀价。倍数，即为血清的沉淀价。 琼脂免疫扩散试验 v琼脂的作用琼脂的作用 v抗原抗体在琼脂凝胶

11、中扩散，当二者在比例抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例 适当处相遇，即发生沉淀反应，形成肉眼可适当处相遇，即发生沉淀反应，形成肉眼可 见的沉淀带，此种反应称为琼脂免疫扩散，见的沉淀带，此种反应称为琼脂免疫扩散， 又简称琼脂扩散和免疫扩散。又简称琼脂扩散和免疫扩散。 单向单扩散单向单扩散 单向双扩散单向双扩散 双向单扩散双向单扩散 双向双扩散双向双扩散 免疫电泳技术 v免疫电泳免疫电泳 v对流免疫电泳对流免疫电泳 v火箭免疫电泳火箭免疫电泳 二、标记抗体技术二、标记抗体技术 v抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原 抗体复合物是不可见的。抗体复合物是不可

12、见的。 v将特殊物质标记在抗体分子上，通过检测标将特殊物质标记在抗体分子上，通过检测标 记分子来显示抗原抗体复合物的存在，即根记分子来显示抗原抗体复合物的存在，即根 据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感 性建立的技术，称为性建立的技术，称为标记抗体技术标记抗体技术(labelled antibody technique)。 高敏感性的标记分子 v荧光素荧光素 v酶分子酶分子 v放射性同位素放射性同位素 荧光抗体技术荧光抗体技术 酶标抗体技术酶标抗体技术 同位素标记技术同位素标记技术 （一）荧光抗体标记技术 vfluorescent-labelled an

13、tibody technique v是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后 用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪 相应的抗原或抗体的方法。相应的抗原或抗体的方法。 荧光色素 v是能够产生明显荧光，并能作为染料使用是能够产生明显荧光，并能作为染料使用 的有机化学物称为荧光色素或荧光染料。的有机化学物称为荧光色素或荧光染料。 v可用于标记的荧光素有可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)、四乙基罗丹明四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基和四甲基 异硫氰酸罗丹明异硫氰酸罗丹明(TRITC) 染色原理及

14、方法 vFITC含有异硫氰基，能与含有异硫氰基，能与IgG分子自由基分子自由基 结合，形成结合，形成FITC-IgG复合物，且不影响结复合物，且不影响结 合抗原的能力和特异性，因此，当荧光抗合抗原的能力和特异性，因此，当荧光抗 体与抗原结合后形成有荧光性的抗原抗体体与抗原结合后形成有荧光性的抗原抗体 复合物复合物 v常用直接法与间接法常用直接法与间接法 v将将SPA标记标记FITC制成制成FITC-SPA （二）酶标抗体技术 v根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应 的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。 v基本程序：标记抗原

15、抗体复合物底物基本程序：标记抗原抗体复合物底物 v根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应 的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相 应抗体或抗原的量呈正比。应抗体或抗原的量呈正比。 用于标记的酶 v用于标记的酶有辣根过氧化物酶用于标记的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶 vHRP的作用底物为过氧化氢，催化时可使供氢体产生的作用底物为过氧化氢，催化时可使供氢体产生 一定颜色一定颜色 v邻苯二胺邻苯二胺(OPD)，显色呈橙色，显色呈橙色，492

16、nm v四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMB），），显色呈蓝色，显色呈蓝色，450或或650nm v3，3二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB)。反应后的氧化型中间体反应后的氧化型中间体 迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物。迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物。 酶联免疫吸附试验(ELISA) vELISA是当前应用最广、发展最快的一项是当前应用最广、发展最快的一项 新技术。其基本过程是将抗原新技术。其基本过程是将抗原(或抗体或抗体)吸吸 附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色 反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判 定结果。定结果。

17、 ：聚苯乙烯微量滴定板（珠），硝纤膜：聚苯乙烯微量滴定板（珠），硝纤膜 ：牢固的吸附在载体表面，保持免疫原性：牢固的吸附在载体表面，保持免疫原性 可溶性物质或蛋白质抗原易包被可溶性物质或蛋白质抗原易包被 较大的病毒、细菌需打碎或提取抗原较大的病毒、细菌需打碎或提取抗原 用于包被的抗原或抗体需要纯化用于包被的抗原或抗体需要纯化 包被的蛋白质浓度通常为包被的蛋白质浓度通常为110ug/ml 0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液包被碳酸盐缓冲液包被 4过夜或过夜或3723h，4 或或-20 保存保存 ELISA实验中的影响因素实验中的影响因素 ：PBST ELISA的核心是利用抗原抗体的特的核心

18、是利用抗原抗体的特 异性吸附，在固相载体上一层层地叠加异性吸附，在固相载体上一层层地叠加 试验方法主要有以下几种 vBA-ELISA:抗原、待检血清、生物素化的二抗原、待检血清、生物素化的二 抗、酶标生物素抗、酶标生物素 vBAB-ELISA:抗原、待检血清、生物素化的抗原、待检血清、生物素化的 二抗、亲和素、酶标生物素二抗、亲和素、酶标生物素 vABC-ELISA:抗原、待检血清、生物素化的抗原、待检血清、生物素化的 二抗、酶标记亲和素与生物素复合物二抗、酶标记亲和素与生物素复合物 vDot-ELISA 免疫组化染色技术 v标本制备和处理：组织切片、压片、涂片、细胞标本制备和处理：组织切片、压片、涂片、细胞 盖片；消除内源性过氧化酶盖片；消除内源性过氧化酶 v染色：间接法、直接法染色：间接法、直接法 v显色显色 v观察观察 （三）放射免疫测定（RIA） v将同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反将同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反 应的高度特异性结合起来而建立的免疫分应的高度特异性结合起来而建立的免疫分 析技术析技术 v可定量分析