仲景炙法原貌考证及炙甘草抗溃疡作用的研究

1、仲景“炙”法原貌考证及炙甘草抗溃疡作用的研究背景甘草是张仲景最常用的药物之一 , 在伤寒论中记载了生甘草、炙甘 草两种规格 , 其中炙甘草最为常用。伤寒论中虽记载了甘草的炮制方法 , 但对 炮制的过程没有详细的论述。现今所说的炙甘草多指蜜炙甘草 , 本团队在考证甘草炮制沿革的过程中发现 汉代到清代出现过的甘草炮制方法有炙法、炒法、炮法等 6 种;用来炮制的辅料 有酥、盐、醋、蜜等 11 种。其中以蜜炮制甘草的方法最早出现在唐代的千金 翼方中 ,而“蜜炙甘草”清代才出现 , 仲景所用甘草是否为蜜炙甘草 ,仍存在疑问。所以考证伤寒论中甘草炮制方法的原貌并对该炮制方法背后的科学道理 进行探索 , 可

2、能对深入理解仲景辨证论治的学术思想、提高经方运用水平有重要 的意义。目的 1. 通过文献考证出伤寒论中炙甘草炮制方法的原貌。2. 利用药效学实验筛选出高温炮制后甘草中抗溃疡的有效成分 ( 以下简称有 效成分); 优化能够制备出活性最佳的有效成分的工艺 , 并对其形貌特征、光学性 质、元素组成、表面活性基团进行分析 ; 研究有效成分的细胞毒性、抗溃疡作用 及作用机制。 3. 分析有效成分对生甘草水溶液中小分子溶出度的影响。评价其对生甘草抗溃疡作用及相关作用机制的影响。方法1. 利用马弗炉将 甘草高温碳化 , 以透析的方法将碳化甘草的水煎液分离为透析袋内和透析袋外两 种溶液, 以急性酒精性胃溃疡模

3、型初步评价两种溶液的抗溃疡作用 ,以发现其有效成分。2. 考察利用马弗炉制备碳化甘草及其有效成分的温度和时间 , 利用荧光光谱、 红外光谱、紫外光谱初步观察不同条件下制备的有效成分的光学性质和所含基团。以透射电子显微镜(TEM)观察不同条件下制备的有效成分的粒径大小、分布均匀 程度。以抗溃疡效果为评价指标 , 优化碳化甘草中有效成分的制备条件。 3. 利用TEM高分辨透射电子显微镜(HRTEM、X射线衍射技术(XRD)分析碳化甘草中有效成分的形貌特征、粒径大小和晶格间距 ; 利用荧光光谱、红外光谱、紫外光谱 初步观察光学性质和所含基团；利用XPS分析其的元素组成及表面基团分布。以高效液相色谱法

4、分析碳化甘草中有效成分与生甘草所含成分的异同。 4.利用细胞增殖及毒性检测试剂盒检测不同浓度碳化甘草中有效成分溶液对细胞 活力的影响 , 以评价其是否有细胞毒性 , 初步获取安全性参数。5. 利用急性酒精性胃溃疡模型 , 评价有效成分的抗溃疡活性和作用机制。 6.利用高效液相色谱法探索碳化甘草中有效成分对生甘草中小分子溶出度的影响。运用急性酒精性胃溃疡模型考察 GRRC-NGs生甘草和生甘草与GRRC-NC的混合溶液的抗溃疡作用和抗氧化机制 , 初步评价碳化甘草对生甘草药效的影响。结果 1. 药效学实验结果表明 , 碳化甘草中有效成分为透析袋内部分。透析袋内溶液组溃疡指数明显低于模型组和透析袋

5、外溶液组 (P<；0.05),而透析袋外溶液与模型组无统计学差异(P 0.05)。组织观察显示：透析袋内溶液 组小鼠的胃黏膜和组织损伤明显轻于模型组和透析袋。2.制备方法考察结果显示,以325C、350C、375C、400E制备的碳化甘草中有效成分 , 粒径均在纳米级别 , 我们将其命名为甘草炭纳米类成分 (GRRC-NCs。)不同温度制备的GRRC-NC所含活性基团相似,温度越高粒径越小,其中375C、400E制备的GRRC-NC符合碳点的形貌特征。综合电镜结果和抗溃疡效果,优选375E作为GRRC-NC的制备温度。进一步考察以375r烧制的时间,结果表明烧制60min和80min时可以

6、制备出分散均匀, 粒径适中的碳点。综合GRRC-NC的形貌特征和抗溃疡活性,最终筛选出制备GRRC-NC的条件 为以马弗炉375r烧制60min。3.GRRC-NCS勺成分分析：形貌特征:GRRC-NCs 为均匀分布的球体，其粒径在2-10nm间均有分布，以5-6nm的最多，符合碳点的粒 径要求。晶格间距为0.357nm,2 0角度为:23.02 光谱分析：荧光光谱结果显 示,GRRC-NCS勺最大激发波长为372nm,最大发射波长为452nm红外光谱显示主要基团有3400cm-1左右的宽大的吸收峰，为O-H特征 峰;2900cm-1处为C-H伸缩振动;1380cm-1处的尖锐吸收峰为C-H;

7、1100cm-1附近 的吸收峰推测为C-O,1000 cm-1以下的小吸收峰为C-H。紫外-可见吸收光谱图显示200nm-500nm间有宽大的吸收峰。200nm-220nm处的吸收峰为 N H S元素的n-厂跃迁，可能为O-H N-H等基团。（3）元素组成及表面活性基团分析：GRRC-NC中有C、ON、P、S等元素, 其中含量最高的两种元素为C和O,分别占总原子百分比的53.95%和40.28%。没有检测到Ca Mg等金属元素，说明GRRC-NC中没有金属离子和盐类。XPS全扫描谱中显示的284.38eV、401.68eV和536.88eV处的峰分别对应于 C 1s、N 1s 和 O 1s。C

8、 1s 可以分成 4个小峰, 分别为 284.8 eV 处的 C-C,285.8 eV 处的C-C-O,286.6 eV处的C-OH和 288.2eV处的C=O;O 1s可以分为3个小峰，分别为 531.2eV处的O=C,533.8 eV处的O-N和534.1eV处的O-Co N可以分为两个小峰，分别是400.6eV处的C-NH2和403.2eV处的N-G(4)以同样的色谱条件下对生甘草水煎液和 GRRC-NC水溶液进行成分分析,结果表明原存在于生甘草水煎液高效液相色谱图中甘草的有效成分的特征峰 ,在GRRC-NC水溶液的色谱图中均没有出现。4.当GRRC-NC浓度为19.5卩g/mL-500

9、0卩g/mL时,没有表现出细胞毒性,反而会提高细胞的存活率。5.GRRC-NC有良好的抗溃疡作用,可以减轻酒精对胃黏膜和组织的氧化损伤。6.GRRC-NC与生甘草以不同的比例混合后的煎煮液中小分子溶出程度明显 升高。当GRRC-NC的含量为30%寸，小分子的溶出度最高。小鼠的胃溃疡指数的结 果表明：相比模型组，GRRC-NC、生甘草、GRRC-NC与生甘草混合溶液均有良好的抗溃疡作用 , 其中混合溶液的抗溃疡效果较好 (P<0.05)。GRRC-NCs生甘草和混合溶液可以降低小鼠血清和胃组织中的MDA和NO的含量(P&It;0.05),显著提高血清中SOD勺含量(P<0.01),结果表明混合溶液 的抗氧化作用优于GRRC-NC和生甘草,且有统计学意义(P<0.05)。结论1.GRRC-NC是甘草高温炮制过程中产生的新物质,利用马弗炉375r烧制60min制备出的GRRC-NC为均匀分布的球体,其粒径在2-10nm间均有分布,以5-6nm 的最多 , 符合碳点的粒径要求。其荧光光谱中最大激发波长为晶格间距为0.357nm,20角度为:23.02 。372nm,最大发射波长为452nm主要元素为C N O,组成了 C-C、C-C-OC-OH、 C-H、 C=O、 O-H、 C-NH2、N-C等基团,不含金属离子、盐类和小分子