单克隆抗体与基因工程抗体制备工作

1、单克隆抗体与基因工程抗体的制备 抗体种类： 第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody) 杂交瘤技术的基本原理 单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性 基因工程抗体制备 一、基因工程抗体种类 二、原理 三、重组抗原制备过程 基本概念 抗原决定簇（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体 是指抗原分 子中决定抗 原特异性的 特殊化学基 团，又称表 位(e

2、pitope). 由一 个B淋 巴细 胞增 殖而 成的 细胞 集团 针对多种抗原决 定簇的混合抗体 由单个B细 胞克隆产生 的针对单一 抗原决定簇 的同源抗体 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克 隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方 亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克 隆化，制备McAb 当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一 起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核 体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细 胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。 杂交瘤技术原理： 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫 的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细

3、胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检 测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小 鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克 隆抗体 流 程 杂交瘤技术 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK- 与提供淋巴细胞的动物品系相同 （一）小鼠骨髓瘤细胞 动 物： BALB/c小鼠 712周龄 20g25g体重 （二）免疫脾细胞 细胞性抗原： （12）107/只，不加佐剂，23 周重复一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原 ，36周100200微克抗原，融合前3 天，加强免疫 免疫小鼠 细胞融合剂： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞 融合剂

4、作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构 重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融 合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批 号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不 同 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10) 50% PEG 1min内加完; 10ml培养液终止反应 融合方法 SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：25 1ml 50%的PEG（无菌，预温37）在1分钟内 滴完,静置45秒,时间一到,将事先准备的培养 液一滴一滴加入,停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96 孔板中时每孔细胞数为（0.51.5）105个 。融合后7-14天，换用HT培养液 细胞融合 720天出现克隆 HAT筛选

5、挑克隆 融合细胞的早期培养 HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物， 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体” ，供细胞通过替代途径合成DNA 杂交瘤细胞的选择性培养 HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成 的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT 缺乏，DNA合成的替代途径受阻 杂交瘤细胞： 长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能

6、力 有限稀释法 特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.51个细胞 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 经过反复克隆化获得的抗体 阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培 养（除及时冻存的细胞外）。因 多次传代易引起染色体逐渐丢失 而使细胞产生抗体能力逐渐减弱 甚至消失，还应尽早使用获得的 抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克 隆抗体。 一、单克隆抗体的产生 动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（510 ）105/只 体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 腹腔注射法 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 二、Mc

7、Ab的纯化 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的 ,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分 析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠 B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤 细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot 三、 单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀 反应 对环境敏感性 （一）单克隆抗体的特性 优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不

8、纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗 体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 单克隆抗体的优点与局限性 局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高 McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高 得量 高 低 特异性 高 低 稳定 低 高 沉淀反应 无 有 成本 高 低 McAb与PcAb的比较 McAb and PcAb 基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图，采用基因工 程方法，在基因水平，对免疫球蛋白 基因进行切割、拼

9、接或修饰后导入受 体细胞进行表达，产生新型抗体。主 要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化 抗体、双价抗体和双特异性抗体。 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在 小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生 大量完全人源化抗体 一、人源化抗体 Fab：抗原结合片断 Fv：可变区片段 ScFv：单链可变区片段 SdAb：单区抗体 二、小分子抗体 其它生物活性蛋白融合 三、抗体融合蛋白 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合 位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两 个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体 连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细 胞结合识别，取得杀伤肿瘤细

10、胞的作用。 四、双特异性抗体 定义：将体外克隆的抗体基因片段插入 噬菌体载体，转染工程细菌进行表达， 然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆 噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完 全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和 肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越 性 五、噬菌体抗体库技术 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA 重组技术的方法，把DNA作为组件， 在细胞外将一种外源DNA（目的基因 ）和载体DNA重新组合连接（重组） ，最后将重组体转入宿主细胞，使外 源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的 繁殖而增殖（cloning，克隆），或最 后得到表达，最终获得基因表达产物 或改变生物原有的遗传性状。 Fore

11、ign DNA to be insertedPlansmid vector Joining Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromateme Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule Cloning + 1、体外基因重组 目的基因的制备 载体的构建：质粒或 噬菌体 目的基因与载体重组 2、重组体DNA的转 化增殖和表达 转化 筛选 增殖和基因表达 PCR技术原理示

12、意图 靶序列 变性和引 物复姓 循环1 循环2 循环3 变性和引 物复姓 链延伸 Tag酶 链延伸 以脂肪酸结合蛋白（FABP）为例： 首先要合成或购买表达FABP的基因序 列并设计合成引物 ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAAGAA TTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTACCAGGCA GGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAAAGAATGGGG ACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAGAACACAGAGATC AGCTTTAAGTT

13、GGGGGTGGAGTTCGATGAGACAACAGCAGATGACAG GAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATGGAGGGAAACTTGTTCACC TGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACCACACTTGTGCGGGAGCTAATT GATGGAAAACTCATCCTGACACTCACCCACGGCACTGCAGTTTGCAC TCGCACTTATGAGAAAGAGGCATGA 上游引物：HF15 CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3 下游引物：HF25 GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3 基因序列 酶切 位

14、点 NdeIXbaI CATATG GTATAC TCTAGA AGATCT TATG AC T AGATC CA GTAT CTAGA T 通过扩增获取足够的联结片段 PCR扩增 0.5 L dNTP（2 mmol/L） 2.0 L Taq酶（5U/L） 0.25L 加ddH2O至 50 L 2、PCR 反应循环条件设置 94变性反应1min；55退 火反应45s；72延伸反应 1min。进行25个循环后，最 后一个循环72延长至10min 。迅速冷却4。 到高效克隆的目的。因为 TA克隆法操作最简单，快 速和高效的原因，成为 Taq聚合酶PCR产物的最佳 克隆方法。 心机、 超净工 作台、

15、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像 系统 PCR产物 T载体 连接缓冲液 连接酶 5 倒置平皿，37过夜培养。 连接 CATATG GTATAC TCTAGA AGATCT 工作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶 成像系统 表达载体 目的片段 Solution I 重组子的鉴定 诱导表达 表达产物的SDS-Page鉴定 离胶时就形成了彼此分离的清晰条带，大大提 高了分辨率。 ，接好电源，开始电泳。 4、染色与脱色 电泳结束后，分离玻璃板，取 出凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考 马氏亮蓝中振荡染色约1h，再转入脱色液中脱 色。 5、用凝胶成像系统进行分析。 表达产物的分离纯化 复性缓冲液（10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA， pH8.0） 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技 术分为： Ion exchange chromatography (IEC) Reversed phase chromatography (RPC) Hydrophobic interaction chrom