分子医学技能-免疫：免疫印迹

1、 Immunoblotting 印迹技术 l印迹技术印迹技术是将生物大分子物质（核酸或蛋白质）是将生物大分子物质（核酸或蛋白质） 通过不同的途径转移到固相载体上，然后与相应通过不同的途径转移到固相载体上，然后与相应 的探针发生化学或免疫学反应，显示谱带的一种的探针发生化学或免疫学反应，显示谱带的一种 方法。方法。 l分类：分类： Southern Blot: 分析分析DNA Northern Blot: 分析分析RNA Western Blot:分析分析蛋白质蛋白质, , 是将凝胶电泳与固是将凝胶电泳与固 相免疫相结合的一种复合免疫技术相免疫相结合的一种复合免疫技术, ,又称又称免疫免疫 印迹

2、印迹。 实验原理 l通过通过SDS-PAGE将抗原按其分子量大小将抗原按其分子量大小分离分离； l转移转移到固相支持载体（硝酸纤维膜）上；到固相支持载体（硝酸纤维膜）上； l封闭空白位点封闭空白位点； l再与抗体共孵育后， 特异性抗体与抗原结合 形成免疫复合物； l用酶标抗体作为示踪 二抗； l加入能形成不溶性显 色物的酶底物，使目的 条带显色，对抗原进行 鉴定。 电极 膜 胶 滤纸 转移槽 优优 点：点： 同时具有同时具有SDS-PAGE的高分辨力和的高分辨力和 固相免疫测定的高特异性和敏感性固相免疫测定的高特异性和敏感性 ； 方法简便；方法简便； 标本可长期保存；标本可长期保存； 结果便于

3、比较。结果便于比较。 实验操作 u蛋白质的蛋白质的SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （已完成）（已完成） u蛋白质从蛋白质从SDS-PAGESDS-PAGE凝胶转移至硝纤膜凝胶转移至硝纤膜 （已完成）（已完成） u封闭硝纤膜的免疫球蛋白结合位点封闭硝纤膜的免疫球蛋白结合位点 （操作内容）（操作内容） u酶标抗体结合与染色酶标抗体结合与染色 （操作内容）（操作内容） lNC膜膜 1条条/组组 l5脱脂奶粉脱脂奶粉 1ml/组组 l一抗溶液一抗溶液 1ml/组组 l酶标抗体酶标抗体 1ml/组组 lPBS 10ml/组组 l小镊子小镊子 1支支/组组 l底物显色液底物显色液 1

4、0ml/班班 1.1.封闭封闭：把：把NCNC膜（已转印）放入小试管中，膜（已转印）放入小试管中， 加入加入5 5脱脂奶粉脱脂奶粉1 1mlml，塞上小胶塞，室温塞上小胶塞，室温 下温育下温育15152020分钟，期间注意缓慢摇动数分钟，期间注意缓慢摇动数 次。次。 2.2.打开胶塞，弃去封闭液，立即加入打开胶塞，弃去封闭液，立即加入一抗一抗溶溶 液与滤膜一同温育液与滤膜一同温育2020分钟。分钟。 3.3.弃去液体，加弃去液体，加PBS（2-3 ml）漂洗漂洗3 3次，每次，每 次次3-53-5分钟。分钟。 4.4.加入加入1 1mlml酶标酶标二抗二抗，37373030分钟，不时分钟，不时 摇动。摇动。 5.5.弃去液体，加入弃去液体，加入PBSPBS（2-3ml2-3ml）漂洗漂洗3 3次次 以上，每次以上，每次3-53-5分钟。分钟。 6.6.加入加入