引物设计需要注意事项[精选.]

1、引物设计需要注意事项一、PCR引物设计的11条黄金法则1. 引物最好在模板 cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAma)n 比对(Alignment )，各基因相同的序列就是该基因的保守区。2. 引物长度一般在 1530碱基之间。引物长度(primer length )常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。3. 引物GC含量在40%60%t间，Tm值最好接近 72C。GC含量(composition )过高或过低都

2、不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(melting temperature )是寡核苷酸的解链温度, 即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm= 4 (G+C +2 (A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的 Tm为5580C，其Tm值最好接近72C以使复性条件最佳。4. 引物3 端要避开密码子的第 3位。如扩增编码区域，引物 3 端不要终止于密码子的第 3位,因密码子的第 3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。5. 引物3 端不能选择 A,最好选择 To引物3端错配时，不同碱基引发效率存在

3、着很大的差异，当末位的碱基为 A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G C错配的引发效率介于 A T之间，所以3端最好选择 T。6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是 3端相似性较高的序列,否则容易导致 错误引发( False priming )。降低引物与模板相似性的一种方法是,引 物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3个连续的G或C,因这样会使引物在 GC富集序列区错误引发。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列 。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成 发夹

4、结构( Hairpin ) 使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模 板的复性结合。 引物自身不能有连续 4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性, 尤其 应避免 3 端的互补重叠以防止 引物二聚体( Dimer 与 Cross dimer) 的形成。引物之间不 能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高(应小于 4.5kcal/mol )。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。8. 引物5端和中间厶G值应该相对较高，而 3端厶G值较低。 G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内

5、部碱基对的相对稳定性， G值越大，则双链越稳定。应当选用5端和中间厶G值相对较高，而3端厶G值较低（绝对值不超过 9）的引物。 引物3端的 G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA聚合反应。（不同位置 的 G值可以用Oligo 6软件进行分析）9. 引物的5端可以修饰，而3 端不可修饰。引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA序列；引入点突变、 插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能

6、有形成任何二级结构可能。10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响， 选择扩增片段时最好避开二级结 构区域。用有关软件（比如RNAstructure ）可以预测估计 mRNA勺稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.61 kJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2 -脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后， 应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具 有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有

7、的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定， 引物设计的选择自由度较低。 在这种情况只能退而求其次， 尽量去满足条件。 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR勺特异性与成功与否。要设计引物首先要找到 DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结 构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为 100600碱基对。让我们先看看

8、P1引物。一般引物序列中 G+C含量一般为40%60%而且四种碱基的分布最 好随机。 不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则 P1 引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计 引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5 端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从 3 端开始的。这里还需提醒的 是3 端不要终止于密码子的第 3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。综上所述我们可以归纳十条 PCR引物的设计原则： 引物应用

9、核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续 4个碱基的互补。 引物之间不能有连续 4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第 3位。二、引物的二次筛选引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank中进行回检。也就是把每条引物在比对工具(http:/www. ncbi. nlm. /blast/)的blast n

10、r中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3端应避免连续5-6 bp的同源。二是以mRNA为模板设计引物时要先利用 生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如http:/CCR-081./GENESCAN.html的GENESCA工具 或者GeneParser软件，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。三、引物的最终评估当我们经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过PCRPCR产物的量是否足够，即无不出PCRT增产物是否与预期 PCR产物大三是是否形成引物二聚体带扩增可以对引物进行最终的评估。一是PCR扩增的特异性和效率。经过P