第22章免疫学检测技术基本原理

1、第22章免疫学检测技术基本原理 第第22章章 免疫学检测原理免疫学检测原理 免疫学检测是指借助免疫学、细胞生物学、 分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、 免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。 临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾 病的诊断、病情检测和疗效评价等。 第22章免疫学检测技术基本原理 第一节第一节 基于抗原基于抗原- -抗体反应的检测方法抗体反应的检测方法 第二节第二节 免疫细胞检测免疫细胞检测 第三节第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用分子生物学技术在免疫学上的应用 本章内容本章内容 第22章免疫学检测技术基本原理 第一节第一节 基于抗原基于抗原- -抗体反应的检测方法抗

2、体反应的检测方法 一、抗原抗体反应概念一、抗原抗体反应概念 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在 合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结 合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗 体存在于血清中，故又称血清学反应。体存在于血清中，故又称血清学反应。 第22章免疫学检测技术基本原理 二、抗原抗体反应的特点二、抗原抗体反应的特点 高度特异性高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。可精确区分物质间极微细

3、的差异。 表示为表示为 亲和力亲和力：一个抗原表位与相应抗体单一抗原：一个抗原表位与相应抗体单一抗原 结合位点间的结合能力。结合位点间的结合能力。 亲合力亲合力：指一个抗体分子与整个抗原大分子：指一个抗体分子与整个抗原大分子 间的结合强度，与抗原表位数目有关。间的结合强度，与抗原表位数目有关。 第22章免疫学检测技术基本原理 2.抗原抗体结合的带现象与可见性抗原抗体结合的带现象与可见性 抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例 （等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应；（等带）决定抗原抗体结

4、合后能否出现肉眼可见的反应； 第22章免疫学检测技术基本原理 3. 表面化学基团之间的可逆结合表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力 和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影 响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层 析法纯化抗原或抗体。析法纯化抗原或抗体。 抗原抗体反应的抗原抗体反应的2个阶段个阶段 第第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完阶段是抗原抗体特异性

5、结合，可在数秒钟至几分钟内完 成；第成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较 大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。 第22章免疫学检测技术基本原理 三、抗原抗体反应的影响因素三、抗原抗体反应的影响因素 电解质电解质 抗原抗体等电点分别为抗原抗体等电点分别为pH3-5和和pH5-6，在中性或，在中性或 弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使 它们失去一部分负电荷而相互结合；它们失去一部分负电荷而相互结合； 温度温度 通常为通常为37，适

6、当提高反应温度可增加抗原与抗体，适当提高反应温度可增加抗原与抗体 分子的碰撞机会，但分子的碰撞机会，但56以上可使抗原或抗体变性失活；以上可使抗原或抗体变性失活； 1.酸碱度酸碱度 抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pH值在值在6-8之间，之间，pH值过高值过高 或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等值接近等 电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现 凝集，导致非特异性反应。凝集，导致非特异性反应。 第22章免疫学检测技术基本原理 四、抗原抗体反应检测技术的应用四、抗原抗体反

7、应检测技术的应用 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合 适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可 呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在 于血清中，故又称血清学反应。于血清中，故又称血清学反应。 第22章免疫学检测技术基本原理 五、抗原五、抗原-抗体反应的基本检测方法抗体反应的基本检测方法 第22章免疫学检测技术基本原理 Ab Ag 高亲和力 Ab Ag 低亲和力 特异性特异性 结合力的

8、表示方法结合力的表示方法亲和力和亲合力亲和力和亲合力 低亲合力 高亲合力 Ag-Ab反应的原理反应的原理 第22章免疫学检测技术基本原理 Ab 过剩Ag 过剩 比例适当，交联成网络 Ag-Ab反应的可见性反应的可见性 第22章免疫学检测技术基本原理 1.凝集反应凝集反应 直接凝 集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况 下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。 玻片法 试管法 常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定 选择最佳稀释浓度， 常用于检测抗体的滴 度或效价，见于临床 诊断伤寒或副伤寒所 用的

9、肥达氏反应和诊 断布氏菌病所用的瑞 特试验。 第22章免疫学检测技术基本原理 间接凝集反应间接凝集反应 将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进 行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O” 试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断： + 病人的病人的RBC体内体内anti-Rh 由于抗体多属于由于抗体多属于IgG，分子，分子 量较小，抗体与红细胞间的量较小，抗体与红细胞间的 结合力不能克服细胞间的排结合力不能克服细胞间的排 斥力，不出现凝集斥力，不出现凝集 + 体外加入体外加入

10、 抗人抗人IgG 出现凝集现象，出现凝集现象， 叫直接库姆试验叫直接库姆试验 正常人正常人O型血型血 的的Rh+的的RBC + 患者血清内的患者血清内的 游离游离anti-Rh + 体外加入体外加入 抗人抗人IgG 出现凝集现象，出现凝集现象， 叫间接库姆试验叫间接库姆试验 第22章免疫学检测技术基本原理 2.沉淀反应沉淀反应 AgAgAgAg Ab in gel 单向免疫扩散单向免疫扩散 Ag1 Ab Ag2Ag3Ag4 双向免疫扩散双向免疫扩散 免疫比浊免疫比浊 过量Ab Ab Ab Ab 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉 淀物，称为沉淀反应。沉淀

11、反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。 鉴定多种抗原是完全相同、鉴定多种抗原是完全相同、 部分相同或完全不同部分相同或完全不同 用于确定用于确定 抗原浓度抗原浓度 第22章免疫学检测技术基本原理 沉淀反应沉淀反应免疫电泳免疫电泳 存在于不同区域的抗原与抗存在于不同区域的抗原与抗 体结合，在比例适宜处形成体结合，在比例适宜处形成 沉淀弧。沉淀弧的数量、位沉淀弧。沉淀弧的数量、位 置和形状与标准品相对比，置和形状与标准品相对比， 可分析样品的成分及其性质。可分析样品的成分及其性质。 第22章免疫学检测技术基本原理 3.免疫标记技术免疫标记技术 免疫酶测定法免疫酶测定法 免疫荧光技术免疫荧

12、光技术 放射免疫测定法放射免疫测定法 免疫胶体金技术免疫胶体金技术 第22章免疫学检测技术基本原理 免疫酶测定法免疫酶测定法 夹心法夹心法ELISA 间接间接ELISA BASELISA 利用生物利用生物 素和抗生物素蛋白为桥梁素和抗生物素蛋白为桥梁 微粒捕获酶免疫分析技术微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的将已知特异性抗体致敏的 免疫微粒与生物素、亲和免疫微粒与生物素、亲和 素、酶相结合，最后酶作素、酶相结合，最后酶作 用于荧光底物发光，通过用于荧光底物发光，通过 检测荧光强度判断未知抗检测荧光强度判断未知抗 原的含量。原的含量。 a） b） 第22章免疫学检测技术基本原理 免疫组

13、化技术免疫组化技术 定位、定性、定量检测 第22章免疫学检测技术基本原理 免疫荧光技术免疫荧光技术 第22章免疫学检测技术基本原理 放射免疫测定放射免疫测定 用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将 同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来， 具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、 药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。 化学发光免疫技术化学发光免疫技术 将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新 的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。 灵敏度高、简便、可实现自动化分析。 第22章免疫学检测技术基本原理 免疫胶体金技术免疫胶体金技术 用胶体金颗粒标记Ab/Ag

14、，以检测未知Ag/Ab的方法。 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的 疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。 第22章免疫学检测技术基本原理 免疫印迹法免疫印迹法-Western blotting 第22章免疫学检测技术基本原理 4.4.蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术 又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微列阵。 根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。 第22章免疫学检测技术基本原理 第二节第二节 免疫细胞检测免疫细胞检测 淋巴细胞及其淋巴细胞及其 亚群的分离亚群

15、的分离 免疫细胞免疫细胞 功能测定功能测定 磁珠分磁珠分 离法离法 免疫吸附免疫吸附 分离法分离法 流式细流式细 胞术胞术 肽肽MHC四聚四聚 体技术体技术 T细胞功细胞功 能测定能测定 B细胞功细胞功 能测定能测定 细胞因细胞因 子检测子检测 T细胞增 殖试验 迟发型超 敏反应的 检测 抗体含 量测定 溶血空 斑试验 巨噬细胞 吞噬试验 细胞毒细胞毒 试验试验 吞噬功吞噬功 能测定能测定 51Cr释放法 乳酸脱氢 酶释放法 细胞染 色法 凋亡细胞 检测法 硝基蓝四 氮唑试验 生物活性 检测法 免疫学检 测法 第22章免疫学检测技术基本原理 一、免疫细胞及其亚类计数一、免疫细胞及其亚类计数 稀

16、释 血液 淋巴细胞 分离液(葡 聚糖-泛影 葡胺 r=1.078) 离心 单 个核细 胞 (PBMC，包 括淋巴细胞、 DC和NK) 红细胞和 粒细胞 血浆 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 第22章免疫学检测技术基本原理 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 稀释 血液 淋巴细胞分 离液(葡聚糖 -泛影葡胺 r=1.078) 离心 单 个核细胞 (PBMC，包 括淋巴细胞、 DC和NK) 红细胞和 粒细胞 血浆 第22章免疫学检测技术基本原理 磁珠分离法磁珠分离法 免疫吸附分离法免疫吸附分离法 流式细胞术流式细胞术 肽肽MHC四聚体技术四聚体技术 淋巴细胞及其亚群的分离淋

17、巴细胞及其亚群的分离 第22章免疫学检测技术基本原理 免疫吸附分离法免疫吸附分离法 加入淋巴 细胞悬液 anti-CD4 anti-CD4 anti-CD4 弃上清 第22章免疫学检测技术基本原理 磁珠分离法磁珠分离法 第22章免疫学检测技术基本原理 流式细胞术流式细胞术 荧光抗体标 记混合细胞 喷嘴 单细胞悬液 5000-10000个/秒 细胞分选器 荧光 检测器 第22章免疫学检测技术基本原理 抗原肽抗原肽-MHC四聚体分离技术四聚体分离技术 亲和素亲和素 抗原肽抗原肽 MHC I 生物素生物素 anti-CD8 肽-四聚体 肽特异性CD8T CD4T及B 非肽特异性CD8T 荧光素荧光素

18、 第22章免疫学检测技术基本原理 二、免疫细胞功能的测定二、免疫细胞功能的测定 T细胞功细胞功 能测定能测定 B细胞功细胞功 能测定能测定 细胞因细胞因 子检测子检测 T细胞增 殖试验 迟发型超 敏反应的 检测 抗体含 量测定 溶血空 斑试验 巨噬细胞 吞噬试验 细胞毒细胞毒 试验试验 吞噬功吞噬功 能测定能测定 51Cr释放法 乳酸脱氢 酶释放法 细胞染 色法 凋亡细胞 检测法 硝基蓝四 氮唑试验 生物活性 检测法 免疫学检 测法 第22章免疫学检测技术基本原理 T细胞功细胞功 能测定能测定 T细胞增 殖试验 迟发型超 敏反应的 检测 T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以

19、下三种 方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核 松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液 体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器， 易有放射性污染。 1. MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法： 外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试， 可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生 以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发 生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈 的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免 疫低下

20、者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。 第22章免疫学检测技术基本原理 B细胞功细胞功 能测定能测定 抗体含 量测定 溶血空 斑试验 可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。 绵羊红细胞 (SRB C)免 疫动物 4天后取出动物 脾脏，在脾细胞 悬液中含有抗 SRBC的浆细胞 脾细胞与 SRBC在适量 琼脂糖液中混 匀 在抗体形成细胞周围出 现溶解的透明区，即溶 血空斑。1个空斑区代表 1个浆细胞 通过记录溶血空斑的数 目可知抗原特异性B细胞 的数目 加入新鲜补体， 倒入平皿中培养 第22章免疫学检测技术基本原理 细胞毒细胞毒 试验试验 51Cr释放法

21、 乳酸脱氢 酶释放法 细胞染 色法 靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损 的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。 第22章免疫学检测技术基本原理 凋亡细胞 检测法 琼脂糖电泳法 正常细胞基因组DNA 凋亡细胞 TUNEL法 在细胞中加入末端脱氧 核苷酸转移酶(TdT)和生 物素标记的核苷酸 TdT能在游离的DNA3端 缺口连接标记的核苷酸 加入亲和素-酶复合物， 在DNA断裂处显色 流式细胞术 Annexin V PI 凋亡 早期 凋亡 晚期 坏死 期 第22章免疫学检测技术基本原理 巨噬细胞 吞噬试验 吞噬功吞噬功 能测定能测定 硝基蓝四氮 唑(NBT)试验 NBT在杀菌

22、过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞 噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。 光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。 将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬 百分率确定mf吞噬能力。 吞噬百分率=吞有红细胞的mf/mf总数 第22章免疫学检测技术基本原理 细胞因细胞因 子检测子检测 生物活性 检测法 免疫学检 测法 夹心ELISA或ELISPOT 荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析 细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或 抑制性细胞株 细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性 细胞损伤 第22章免疫学检测技术基本原理 检测B细胞 产生的抗体 检测T细胞 产生的CK 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验- -ELISpot 第