酶动力学分析课件

1、1 酶动力学分析 2 酶促反应动力学酶促反应动力学 n学习目的：学习目的： n1 1、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。 n2 2、掌握、掌握0 0、1 1级和米氏酶促反应动力学及应用原理；级和米氏酶促反应动力学及应用原理； n3 3、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征；、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征； n4 4、具备固定化酶反应中的过程分析能力和、具备固定化酶反应中的过程分析能力和内外不同内外不同 阶段阶段的固定化酶动力学的应用能力；的固定化酶动力学的应用能力； n5 5、熟悉酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学、熟悉酶的失活动力学与反

2、应过程中酶失活动力学 行为。行为。 3 酶促反应动力学酶促反应动力学 n第一节第一节 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学 n第二节第二节 固定化酶促反应动力学固定化酶促反应动力学 n第三节第三节 酶的失活动力学酶的失活动力学 4 酶促反应酶促反应（Enzymatic reaction）： 研究酶促反应研究酶促反应研究生物反应的基础研究生物反应的基础 酶促反应动力学酶促反应动力学酶催化反应机制酶催化反应机制 对酶促反应速率的规律对酶促反应速率的规律 进行定性或定量的描述进行定性或定量的描述 建立反应动力学方程建立反应动力学方程 确定适宜的操作条件确定适宜的操作条件 5 酶促反应特征酶促反应特征

3、 n优点：优点： n反应在常温、常压、反应在常温、常压、 中性中性pHpH范围进行，范围进行， 节能且效率高。节能且效率高。 n反应专一性强，副产反应专一性强，副产 物生成少；物生成少； n反应体系简单，反应反应体系简单，反应 最适条件易于控制。最适条件易于控制。 n不足：不足： n反应仅限少数步骤，反应仅限少数步骤， 经济性差；经济性差； n反应周期较长；反应周期较长； 6 第一节第一节 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学 n一、酶促反应动力学基础一、酶促反应动力学基础 n二、单底物酶促反应动力学二、单底物酶促反应动力学 1 1、米氏方程、米氏方程 2 2、操作参数对酶促反应的影响、操作参

4、数对酶促反应的影响 3 3、抑制剂对酶促反应速率的影响、抑制剂对酶促反应速率的影响 n三、多底物酶促反应动力学三、多底物酶促反应动力学 7 n均相酶催化反应均相酶催化反应: 指酶与反应物系指酶与反应物系同处液相同处液相的酶催化的酶催化 反应反应. 因此因此不存在不存在相间的相间的物质传递物质传递. n均相酶催化反应动力学所描述的反应均相酶催化反应动力学所描述的反应 速率与反应物系的基本关系速率与反应物系的基本关系,反映了该反映了该 反应过程的反应过程的本征动力学本征动力学关系关系,而且酶与而且酶与 反应物的反应是反应物的反应是分子水平分子水平上的反应上的反应. 8 一、酶促反应动力学基础一、酶

5、促反应动力学基础 影响酶促反应的因素：影响酶促反应的因素： 浓度浓度： 酶浓度酶浓度 底物浓度底物浓度 外部因素（环境因素）：外部因素（环境因素）： 溶液的介电常数溶液的介电常数 与离子强度与离子强度 压力压力 温度温度 pH值值 内部因素（结构因素）：内部因素（结构因素）： 底物浓度及效应物底物浓度及效应物 酶结构酶结构 产物浓度产物浓度 9 n零级反应零级反应 酶促反应速率与底物浓度无关。酶促反应速率与底物浓度无关。 max d S r dt 式中：式中：S底物浓度；底物浓度； rmax最大反应速率。最大反应速率。 （3-1） 10 n一级反应一级反应 酶促反应速率与底物浓度的一次方成正比

6、。酶促反应速率与底物浓度的一次方成正比。 酶催化酶催化AB的反应的反应 10 () db k ab dt 式中：式中： 一级反应速率常数；一级反应速率常数； 底物底物A的初始浓度；的初始浓度； bt时产物时产物B的浓度。的浓度。 1 k 0 a （3-2） 11 n二级反应二级反应 酶催化酶催化A+BC的反应的反应 200 ()() dc k ac bc dt 式中：式中： 二级反应速率常数；二级反应速率常数； 底物底物A和底物和底物B的初始浓度；的初始浓度； ct时产物时产物C的浓度。的浓度。 积分上式，得：积分上式，得： 2 k 00 ,a b 00 2 0000 ()1 ln () b

7、ac k t aba bc （3-3） （3-4） 12 n连锁反应连锁反应 酶催化酶催化A B C的反应的反应 1 12 2 da k a dt db k ak b dt dc k a dt 式中：式中： A，B，C的浓度；的浓度； 各步反应的速率常数；各步反应的速率常数； 12 ,k k , ,a b c （3-5） （3-6） 2 k 1 k （3-7） 13 n如果如果A的初始浓度为的初始浓度为a0， B和和C的初始浓度为的初始浓度为0， 并且并且a+b+c=a0，则可求得：，则可求得： 1 12 12 0 10 21 0 21 21 () (1)(1) k t k tk t k tk

8、 t aa e k a bee kk a ckeke kk （3-8） （3-9） （3-10） 14 二、单底物酶促反应动力学二、单底物酶促反应动力学 n单底物酶促反应指一种反应物（底物）参单底物酶促反应指一种反应物（底物）参 与的不可逆反应。如：水解酶、异构酶和与的不可逆反应。如：水解酶、异构酶和 多数裂解酶催化的反应。多数裂解酶催化的反应。 n1、米氏方程、米氏方程 n Henri中间复合物学说中间复合物学说 n Michaelis-Menten方程方程 n Briggs-Haldane方程方程 n动力学特征（米氏方程的讨论）动力学特征（米氏方程的讨论） n动力学参数的求取动力学参数的求

9、取 15 Henri Henri中间复合物学说：中间复合物学说： n式中：式中： nefree游离酶；游离酶； nCS底物浓度；底物浓度； nCES 酶酶-底物复合物浓度；底物复合物浓度； nCP产物浓度；产物浓度； nK+1酶与底物形成复合物的反应速度常数；酶与底物形成复合物的反应速度常数； nK-1复合物解离为酶和底物的反应速度常数；复合物解离为酶和底物的反应速度常数； nK+2ES复合物分解生成产物的反应速度常数。复合物分解生成产物的反应速度常数。 PE k k +1 -1 ES +2k ES 16 n反应速率：反应速率：单位时间、单位反应体系中某一组单位时间、单位反应体系中某一组 分的

10、变化量来表示。对均相酶催化反应，单位分的变化量来表示。对均相酶催化反应，单位 反应体系常用单位体积表示。反应速率为：反应体系常用单位体积表示。反应速率为： 1 , S S dC r Vdt 1 P P dC r Vdt 式中：rs 底物S的消耗速率，mol/(L.s); rP产物P的生成速率， mol/(L.s); V反应体系的体积，L； CS底物S的物质的量，mol； CP产物P的物质的量，mol； t时间，s； 17 n根据根据质量作用定律质量作用定律，P的生成速率可表示为：的生成速率可表示为： ( 3-11 ) 式中：式中： CES 中间复合物中间复合物ES的浓度，它的浓度，它 为一难测

11、定的未知量，因而不能用它为一难测定的未知量，因而不能用它 来表示最终的速率方程。来表示最终的速率方程。 2PES rk C 18 对上述反应机理，推导动力学方对上述反应机理，推导动力学方 程时的三点假设：程时的三点假设： n（1）在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即：）在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即： CE0=CE+CES。 n（2）与底物浓度）与底物浓度CS相比，酶的浓度是很小的，相比，酶的浓度是很小的， 因而可以忽略由于生成中间复合物因而可以忽略由于生成中间复合物ES而消耗而消耗 的底物。的底物。 n（3）产物的浓度是很低的，因而产物的抑制）产物的浓度是很低的，因而产物的抑制 作用可以忽

12、略，也不必考虑作用可以忽略，也不必考虑P+EES这个逆这个逆 反应的存在。反应的存在。 n据此假设所确定的方程仅适用于反应初始状态。据此假设所确定的方程仅适用于反应初始状态。 19 Michaelis-MentenMichaelis-Menten方程方程推导过程：推导过程： n“快速平衡学说快速平衡学说”（rapid equilirium）: 假设：酶与底物反应生成复合物假设：酶与底物反应生成复合物, ,和复合物又和复合物又 解离成酶和底物的反应之间快速建立平衡解离成酶和底物的反应之间快速建立平衡, ,而而 复合物解离成产物和酶复合物解离成产物和酶, ,即即ESE+PESE+P是整个反应是整个

13、反应 的限速步骤，即由酶和底物反应生成中间复合的限速步骤，即由酶和底物反应生成中间复合 物的可逆反应在初速度测定时间内已经达到平物的可逆反应在初速度测定时间内已经达到平 衡。衡。 20 n根据上述假设和式（根据上述假设和式（3-11），有），有: 2ES SP P Ck dt dC dt dC r 和和 11ESSE CkCCk 或表示为：或表示为： S ES S S ES E C C K C C k k C 1 1 式中：式中：CE游离酶的浓度，游离酶的浓度，mol/L； CS底物的浓度，底物的浓度，mol/L; KS解离常数，解离常数， mol/L; 21 n反应体系中酶的总浓度反应体系中

14、酶的总浓度CE0为：为： 0 ESEE CCC )1 ( 0 S S ESES S ES SE C K CC C C KC 所以：所以： 即：即： SS SE ES KC CC C 0 SS SP SS SE P CK Cr CK CCk r max,2 0 ( 3-12 ) 式中：式中： r P,max产物的最大生成速率，产物的最大生成速率，mol/(L . s); CE0酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，mol/L; 22 n式（式（3-12）即米氏方程，式中的两个动）即米氏方程，式中的两个动 力学参数是力学参数是KS和和rP,max。其中：。其中： 1 1 ES

15、 ES S C CC k k K KS表示了酶与底物相互作用的特性。表示了酶与底物相互作用的特性。KS的单位和的单位和CS的单位相同，的单位相同， 当当rP=1/2 rP,max 时，存在时，存在KS=CS关系。关系。 rP,max =k+2CE0。表示当全部酶都呈复合物状态时的反应速率。表示当全部酶都呈复合物状态时的反应速率。 k+2又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底 物发生反应的分子数，因次，它表示酶催化反应能力的大小，物发生反应的分子数，因次，它表示酶催化反应能力的大小， 不同的酶反应其值不同。不同的酶反应其值不同。 rP

16、,max正比于酶的初始浓度正比于酶的初始浓度CE0。实际应用中将。实际应用中将k+2和和CE0合并应合并应 用为一个参数。用为一个参数。 23 Briggs-Haldane Briggs-Haldane方程方程 n19251925年，年，BriggsBriggs和和HaldaneHaldane对米氏方程的推导作了对米氏方程的推导作了 一项很重要的修正。他们认为，当一项很重要的修正。他们认为，当k k+2 +2 k k-1 -1时米氏时米氏 假设中的快速平衡（假设中的快速平衡（ripid equilibriumripid equilibrium）不一定能够）不一定能够 成立，所以，不能用上述成立

17、，所以，不能用上述“平衡学说平衡学说”推导。即当推导。即当 从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物 的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。 他们提出了他们提出了“拟稳态拟稳态”假设，认为由于反应体系中假设，认为由于反应体系中 底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时 所产生的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系所产生的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系 中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随 时间

18、而变化。时间而变化。 24 n根据反应机理和上述假设，有下述方程式：根据反应机理和上述假设，有下述方程式： 2ES P Ck dt dC 11ESSE S CkCCk dt dC 0 211 ESESSE ES CkCkCCk dt dC 又因为有：又因为有： 0 ESEE CCC 所以：所以： S SE ES C k kk CC C 1 21 0 25 n式中：式中：Km米氏常数，米氏常数，mol/L; nKm与与Ks的关系为：的关系为： Sm SP S SE P CK Cr C k kk CCk r max, 1 21 2 0 ( 3-13) 1 2 1 21 k k K k kk K S

19、m ( 3-14 ) 当当k+2k-1时，时，Km=Ks，即生成产物的速率大，即生成产物的速率大 大慢于酶底物复合物解离的速率。大慢于酶底物复合物解离的速率。 Km值的大小与酶、反应物系的特性以及反应条值的大小与酶、反应物系的特性以及反应条 件有关。件有关。 26 某些酶促反应的某些酶促反应的Km值：值：P30表表3-1 M-M方程与方程与B-H方程比较见下表方程比较见下表 27 n在在M-M方程和方程和B-H方程的推导中都假设方程的推导中都假设CE0CS0，因，因 而而CES值也很小。如果酶的浓度很高，值也很小。如果酶的浓度很高， CES值在反应值在反应 过程中有可能是很高的。若仍然采用上述

20、方程会带来过程中有可能是很高的。若仍然采用上述方程会带来 较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示为：较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示为： 0 ESEE CCC PESSS CCCC 0 11 )( 00 ESPESSESE S CkCCCCCk dt dC 211 )()( 00 ESPESSESE ES CkkCCCCCk dt dC 2ES P Ck dt dC 28 动力学特征（米氏方程的讨论）动力学特征（米氏方程的讨论） n根据米氏方程，根据米氏方程， 酶反应的速度酶反应的速度 与底物浓度的与底物浓度的 关系为一双曲关系为一双曲 线，线，P30P30图图3-13-1。 该曲线表示

21、了该曲线表示了 三个不同动力三个不同动力 学特点的区域。学特点的区域。 29 n当当CSKm，即底物浓度比，即底物浓度比Km值小很多时，该值小很多时，该 曲线近似为一直线。表示反应速率与底物浓度曲线近似为一直线。表示反应速率与底物浓度 近似成正比关系，此时酶催化反应成为一级反近似成正比关系，此时酶催化反应成为一级反 应速率方程。应速率方程。 S m S S KC K Cr r max 当当Km值很大时，大部分酶为游离态的酶，而值很大时，大部分酶为游离态的酶，而CES 的量很少。要想提高反应速率，只有通过提高的量很少。要想提高反应速率，只有通过提高CS值，值， 进而提高进而提高CES，才能使反应

22、速率加快。因而此时反，才能使反应速率加快。因而此时反 应速率主要取决于底物浓度的变化。应速率主要取决于底物浓度的变化。 将上式进行重排，积分，可以推出将上式进行重排，积分，可以推出 S S m C C Ktr 0 ln max ( 3-15 ) 30 式中：式中：CS0底物的初始浓度，底物的初始浓度，mol/L; 这个原理在酶法分析中被应用。利用这个原理在酶法分析中被应用。利用 酶测定底物时，可使用足够量的酶以酶测定底物时，可使用足够量的酶以 便在较短时间内，使反应达到完全。便在较短时间内，使反应达到完全。 这样测定形成的产物总量就与待测物这样测定形成的产物总量就与待测物 的量相等或相关。的量

23、相等或相关。 t K r CC m SS max exp 0 31 n当当CSKm时，该曲线近似为一水平线，表示时，该曲线近似为一水平线，表示 当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。 此时酶反应可视为此时酶反应可视为零级反应零级反应，反应速率将不随，反应速率将不随 底物浓度的变化而变化。这是因为当底物浓度的变化而变化。这是因为当Km值很值很 小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内 游离的酶很少，因而即使提高底物的浓度，也游离的酶很少，因而即使提高底物的浓度，也 不能提高其反应速率。不能提高其反应速率。 max

24、rr S ( 3-16) SS CCtr 0 max trCC SSmax 0 即：即： 或：或： 32 n当当CS与与Km的数量关系处于上述两者之间的范的数量关系处于上述两者之间的范 围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在 t=0时，时，CS=CS0，对（，对（2-13）式积分得到：）式积分得到： S S mSS C C KCCtr 0 0 ln)( max S mSS X KXCtr 1 1 ln 0 max 或：或： 式中：式中： 0 0 S SS S C CC X ，XS为底物转化率。为底物转化率。 Levenspiel提出亦可用幂函数形式表示米氏

25、方程，为：提出亦可用幂函数形式表示米氏方程，为： Sm m CK K SS Crr max 33 n总结：总结： nM-M方程平衡假设：方程平衡假设： 游离态酶浓度 复合态酶浓度 s S S ESE ES ESSESE ESSE K C C k k CC C CkCCCk CkCCk 1 1 11 11 0 0 B-H方程拟稳态假设：方程拟稳态假设： 游离态酶浓度 复合态酶浓度 m S S ESE ES ESSESE ESESSESE K C C kk k CC C kkCCCCk CKCkCCCk 21 1 211 211 0 0 0 )()( 0)( 34 动力学参数的求取动力学参数的求取

26、 n将米氏方程线性化，用作图法求取动力将米氏方程线性化，用作图法求取动力 学参数学参数rmax（或（或k+2）和）和Km值。值。 nA、Lineweaker-Burk法（法（L-B法）法） nB、Hanes-Woolf法（法（H-W法）法） nC、Eadie-Hofstee法（法（E-H法）法） nD、积分法、积分法 35 A A、Lineweaker-BurkLineweaker-Burk法（法（L-BL-B法）法） n将米氏方程取倒数，得到：将米氏方程取倒数，得到： S m S Cr K rr 111 maxmax 以以1/rs对对1/CS作图得一直线，斜率为作图得一直线，斜率为Km/rm

27、ax， 直线与纵轴交于直线与纵轴交于1/rmax，与横轴交于，与横轴交于-1/Km。此。此 法称双倒数图解法。见图法称双倒数图解法。见图2-2（a）。）。 36 B B、Hanes-WoolfHanes-Woolf法（法（H-WH-W法）法） n上式两边均乘以上式两边均乘以CS，得到：，得到： max S max m S S r C r K r C 以以CS/rS对对CS作图，得一直线，斜率为作图，得一直线，斜率为1/rmax，直线，直线 与纵轴交点为与纵轴交点为Km/rmax，与横轴交点为，与横轴交点为-Km。 见图见图2-2（b）。）。 37 C C、Eadie-HofsteeEadie-

28、Hofstee法（法（E-HE-H法）法） n将米氏方程重排为：将米氏方程重排为： S S mS C r Krr max 以以rS对对rS/CS作图，得一直线，斜率为作图，得一直线，斜率为-Km， 与纵轴交点为与纵轴交点为rmax，与横轴交点为，与横轴交点为rmax/Km。 见图见图2-2（c） 38 D、积分法、积分法 n将动力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入将动力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入 米氏方程的积分形式，经整理得到：米氏方程的积分形式，经整理得到： mSSmSS S S KCC t K r CC C C 1 ln 00 0 max SS S S CC C C 0 0 l

29、n 与与 SS CC t 0 对应作图，得到图对应作图，得到图2-2（d） 39 应用直线作图法求取动力学参数：应用直线作图法求取动力学参数： 40 n练习：练习： nP31P31例例3-33-3葡萄糖在葡萄糖异构酶存在时葡萄糖在葡萄糖异构酶存在时 转化为果糖的反应是可逆反应，在平衡转化为果糖的反应是可逆反应，在平衡 状态下，底物和产物都有相当的量，必状态下，底物和产物都有相当的量，必 须考虑逆反应。须考虑逆反应。 n请参见解题和请参见解题和生物反应器工程生物反应器工程P11P11， 三、可逆反应，双底物反应和辅因子活三、可逆反应，双底物反应和辅因子活 化动力学。化动力学。 41 2、操作参数

30、对酶促反应的影响、操作参数对酶促反应的影响 n在诸多影响酶催化活性的因素中，比较重在诸多影响酶催化活性的因素中，比较重 要的有要的有pH值、温度、流体力、化学试剂和值、温度、流体力、化学试剂和 辐射（声、光等）。其中最常遇到，影响辐射（声、光等）。其中最常遇到，影响 最大的是最大的是pH值和温度的作用。值和温度的作用。 npH值的影响值的影响 n温度的影响温度的影响 42 pH值的影响值的影响 构成酶蛋白的氨基酸含构成酶蛋白的氨基酸含 有碱性、中性和酸性基团。有碱性、中性和酸性基团。 在一定的在一定的pHpH值下，酶具有值下，酶具有 带正电荷基团也带有负电荷带正电荷基团也带有负电荷 基团，而这

31、些基团常是构成基团，而这些基团常是构成 活性点的部分。一种酶往往活性点的部分。一种酶往往 只是在一种特定的电荷状态只是在一种特定的电荷状态 下才具有催化活性。随着下才具有催化活性。随着 pHpH值的变化，具有这种特值的变化，具有这种特 定电荷状态的酶只占有总酶定电荷状态的酶只占有总酶 的或多或少的一部分，酶的的或多或少的一部分，酶的 相对活力有一个最大值，即相对活力有一个最大值，即 相对活力相对活力-pH-pH曲线常呈钟罩曲线常呈钟罩 形，见图。形，见图。 43 n根据以上分析，根据以上分析，Michaelis对对pH值与酶活力的关值与酶活力的关 系提出系提出三状态模型三状态模型的假设，基本点

32、如下：的假设，基本点如下： n1、假定酶分子有两个可解离的基团，随着、假定酶分子有两个可解离的基团，随着pH值值 的变化，分别呈现出的变化，分别呈现出EH2、EH-及及E2-三种状态，即：三种状态，即： EH2 EH- E2- -H + +H + -H + +H + n酸性条件下，酶呈酸性条件下，酶呈EH2状态；当状态；当pH增加，酶以增加，酶以EH-状状 态存在；当态存在；当pH继续增加，酶以继续增加，酶以E2-状态存在。状态存在。 n2、上述三种解离状态中，只有、上述三种解离状态中，只有EH-型具有催化活性。型具有催化活性。 n3、底物、底物S的解离状态不变。的解离状态不变。 n4、速率控

33、制步骤为由、速率控制步骤为由EHS-生成产物生成产物P的速率。的速率。 44 n反应机理式可表示为：反应机理式可表示为： k-1 k+2 EH 2 2 S+EH - E 2- EHS - ES 2- EH S k+1 Ka Kb K K a b EH +P - 根据酶催化反应动力学的一般原理，可有下述的基本关系式：根据酶催化反应动力学的一般原理，可有下述的基本关系式： 0 dt dC EHS ( 3-29 ) 2 2 2 20ESEHS SEH EEH EHE CCCCCCC ( 3-30 ) 2 SP EHS rrk C ( 3-31 ) 45 n若定义：若定义： n经整理可得到下式：经整理

34、可得到下式： n式中：式中：Ka、Ka,、Kb、Kb,电离平衡常数，氢离子浓度。电离平衡常数，氢离子浓度。 n CH+氢离子浓度。氢离子浓度。 , 2 EH HEH a C CC K EH HE b C CC K 2 , 2S EH HEHS a C CC K 2 EHS HES b C CC K ( 3-3235 ) 0 2 2 12 ES P EHS mS k C C rk C f Kf C Sm S Sm S CK Cr C f f K C f r max 2 1 2 max ( 3-36 ) ,1 1 H b a H C K K C f 2 1 bH a H C K f KC 46 n

35、由上式可以看由上式可以看 出，出，f f1 1和和f f2 2均与均与 pHpH值有关。值有关。 P21P21图图2-32-3表示表示 了了pHpH值的变化值的变化 对反应速率相对反应速率相 对值的影响。对值的影响。 从该图可以看从该图可以看 出，对酶催化出，对酶催化 反应适宜的反应适宜的pHpH 值约处于值约处于6 69 9 之间。之间。 图图3-3 47 温度的影响温度的影响 n温度对酶催化反应的影响是，在较低的温度范温度对酶催化反应的影响是，在较低的温度范 围内，反应速率随着温度的升高而加快，超过围内，反应速率随着温度的升高而加快，超过 某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上，某一温度，

36、即酶被加热到生理允许温度以上， 酶的反应速率反而随着温度的上升而下降。这酶的反应速率反而随着温度的上升而下降。这 是因为温度升高，虽然可加速酶的催化反应速是因为温度升高，虽然可加速酶的催化反应速 率，同时也加快了酶的失活速率。率，同时也加快了酶的失活速率。 n在适宜的温度内，酶催化反应速率常数中的在适宜的温度内，酶催化反应速率常数中的 k+2与温度的关系符合与温度的关系符合Arrhenius方程。方程。 48 n即：即： n式中：式中： nA指前因子；指前因子； nEa反应活化能；反应活化能； nR气体常数；气体常数； T绝对温度；绝对温度； )exp( 2 RTEAk a ( 3-37) 如

37、果以如果以lgklgk+2 +2对 对1/T1/T对对 应作图，可得一直应作图，可得一直 线，由该直线的斜线，由该直线的斜 率可求得活化能率可求得活化能EaEa 值，该直线是以肌值，该直线是以肌 球蛋白酶催化的球蛋白酶催化的ATPATP 水解反应的数据做水解反应的数据做 出的。出的。 图图2-4 49 n酶反应的酶反应的EaEa值，通常是正值，如能服从值，通常是正值，如能服从 式（式（3-373-37），当温度升高时，反应速率），当温度升高时，反应速率 应会不断地增大，但实际上并非如此，应会不断地增大，但实际上并非如此， 该式只局限于比较狭小的较低温度范围该式只局限于比较狭小的较低温度范围 内

38、才成立。在较高的温度范围内，酶因内才成立。在较高的温度范围内，酶因 热失活，具有活性的酶量减少，因而使热失活，具有活性的酶量减少，因而使 反应速率下降。因此出现一最佳的温度反应速率下降。因此出现一最佳的温度 范围。范围。P35P35图图3-43-4中曲线中曲线a a表示的是过氧化表示的是过氧化 氢酶催化氢酶催化H H2 2OO2 2分解时反应速率与温度的分解时反应速率与温度的 关系，该反应的反应速率也就是氧的产关系，该反应的反应速率也就是氧的产 生速率。生速率。 50 3 3、抑制剂对酶促反应速率的影响、抑制剂对酶促反应速率的影响 n酶反应速率降低的原因：酶反应速率降低的原因： n失活失活指物

39、理或化学因素部分或全部破坏了指物理或化学因素部分或全部破坏了 酶的三维结构，引起酶的变性，导致酶部分或酶的三维结构，引起酶的变性，导致酶部分或 全部丧失活性。全部丧失活性。 n抑制抑制指在酶不变性条件下，由于活性中心指在酶不变性条件下，由于活性中心 化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。 n抑制剂抑制剂导致抑制作用产生的物质称为酶抑导致抑制作用产生的物质称为酶抑 制剂。制剂。 51 抑制作用：抑制作用： 可逆抑制：可逆抑制：不可逆抑制：不可逆抑制： 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制 混合型抑制混合型抑制 52

40、 竞争性抑制动力学竞争性抑制动力学 n若在反应体系中存在有与若在反应体系中存在有与底物底物 结构相类似的物质，结构相类似的物质，该物质也该物质也 能在酶的活性部位能在酶的活性部位 上结合，从上结合，从 而阻碍了酶与底物的结合，使而阻碍了酶与底物的结合，使 酶催化底物的反应速率下降。酶催化底物的反应速率下降。 这种抑制称为这种抑制称为竞争性抑制竞争性抑制。该。该 物质称为物质称为竞争性抑制剂竞争性抑制剂。 n主要特点：主要特点： n抑制剂与底物竞争酶的活性抑制剂与底物竞争酶的活性 部位，当抑制剂与酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性 部位结合后，底物不能再与部位结合后，底物不能再与 酶结合，反之亦然

41、。酶结合，反之亦然。 E S I 53 n如： n竞争性抑制的机理为：竞争性抑制的机理为： n式中：I-抑制剂 n EI-非活性复合物 延胡索酸琥珀酸 琥珀酸脱氢酶 SE PE IE EI ES +2k k k-1 +1 k k +3 -3 丙二酸丙二酸 54 n反应中底物的反应速率方程为反应中底物的反应速率方程为 n根据稳态假设，可列出下述方程：根据稳态假设，可列出下述方程： n式中：式中：CI-抑制剂浓度抑制剂浓度 n CEI-非活性复合物浓度非活性复合物浓度 2ESSI Ckr 0)( 211 ESSE ES CkkCCk dt dC 0 33 EIIE EI CkCCk dt dC 0

42、 EIESEE CCCC 55 n前面公式经整理可得下式前面公式经整理可得下式： smI S S I I m s SI CK Cr C K C K Cr r maxmax 1 式中：式中：rSI有抑制时的反应速率，有抑制时的反应速率，mol/(L.s); KmI 有竞争性抑制时的米氏常数，有竞争性抑制时的米氏常数，mol/(L.s); KI抑制剂的解离常数，抑制剂的解离常数， mol/L; 竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变。竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变。 当当CI增加或增加或KI减小，都将使减小，都将使KmI值增大，使酶与底物值增大，使酶与底物 的结合能力下降，活性

43、复合物减少，因而使底物反应的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应 速率下降。速率下降。 （2-竟抑制）竟抑制） 56 无抑制与竞争性抑制的反应速率无抑制与竞争性抑制的反应速率 与底物浓度的关系曲线图：与底物浓度的关系曲线图： 57 n对（对（2-竟抑制）式取倒数，得到：竟抑制）式取倒数，得到： SI Im SI CK C r K rr 1 1 11 maxmax S mI SI Cr K rr 111 maxmax 或：或： 以以1/rSI对对1/CS作图，可得到一直线，该直线的斜率作图，可得到一直线，该直线的斜率 为为KmI /rmax，与纵轴交点为，与纵轴交点为1/rmax，与横轴

44、交点为，与横轴交点为- 1/KmI。又：。又： I I m m I I mmI C K K K K C KK 1 以以KmI对对CI作图，并根据此图求出作图，并根据此图求出Km和和KI值。值。 58 竞争性抑制动力学参数求取图竞争性抑制动力学参数求取图： 59 n抑制剂的解离常数抑制剂的解离常数KI可表示为可表示为： n由此可看出，由此可看出，K KI I愈小，表明抑制剂与酶的结合愈小，表明抑制剂与酶的结合 力愈强，对酶的催化反应能力的抑制作用就越力愈强，对酶的催化反应能力的抑制作用就越 强。强。 n当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时， K KmI

45、mI与 与C CI I的关系为一直线可称为的关系为一直线可称为线性线性竞争抑制；竞争抑制； 如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相 结合，则结合，则K KmI mI与 与C CI I的关系为一的关系为一抛物线抛物线，可称为抛，可称为抛 物线型的竞争抑制。物线型的竞争抑制。 3 3 k k K I 60 非竞争性抑制动力学非竞争性抑制动力学 n非竞争性抑制：抑制剂与酶分子的结合点不在酶催非竞争性抑制：抑制剂与酶分子的结合点不在酶催 化反应的活性部位，底物与酶的结合并不影响抑制化反应的活性部位，底物与酶的结合并不影响抑制 剂与酶的结合，而抑制剂与酶的结合却

46、阻止底物与剂与酶的结合，而抑制剂与酶的结合却阻止底物与 酶的结合，这种现象称为非竞争性抑制。酶的结合，这种现象称为非竞争性抑制。 E S I S I E 61 n在非竞争性抑制中抑制剂即可与游离的酶相结合，在非竞争性抑制中抑制剂即可与游离的酶相结合， 也可与复合物也可与复合物ESES相结合，生成了底物相结合，生成了底物- -酶酶- -抑制剂抑制剂 的复合物的复合物SEISEI。绝大多数的情况是复合物。绝大多数的情况是复合物SEISEI为为 一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物， 即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。即使增大底物的浓度也不能解除

47、抑制剂的影响。 还有一种是三元复合物还有一种是三元复合物SEISEI也能分解为产产物，也能分解为产产物， 但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。机但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。机 理式表示如下：理式表示如下： k k +1 -1SE ES +2k PE IE k k +3 -3 EI SEI k k+4 -4 SEI IES SEI k k+5 -5 62 n从机理可知存在关系：从机理可知存在关系： 0 SEIEIESEE CCCCC 式中：式中：CESI底物底物-酶酶-抑制剂三元复合物浓度。抑制剂三元复合物浓度。 0 dt dC dt dC dt dC SEIERES sm sI

48、 sm I I S ESSI CK Cr CK K C Cr Ckr max, max 2 )(1 ( ( 2-非竟抑制非竟抑制 ) 式中：式中：rR,max存在非竞争性抑制时的最大反应速率。存在非竞争性抑制时的最大反应速率。 63 n对于非竞争性对于非竞争性 抑制，由于抑抑制，由于抑 制剂的作用使制剂的作用使 最大反应速率最大反应速率 降低了降低了 倍，倍， 并且并且C CI I增加、增加、 K KI I减少都使其减少都使其 抑制程度增加。抑制程度增加。 此时此时r rSI SI对对C CS S的的 关系如图关系如图2-62-6 所示。所示。 I I K C 1 64 n根据根据L-B作图法

49、，式作图法，式( 2-非竟抑制非竟抑制 )可整理为：可整理为： n或或 S m I I I I SI Cr K K C r K C r 1 11 1 maxmax SI m ISI Cr K rr 111 max,max, n以以 与与 作图，可得如图作图，可得如图 所示的直线关系。并求出所示的直线关系。并求出 Km和和r I,max值。值。 SI r 1 S C 1 65 n又根据又根据 n通过实验测得不同通过实验测得不同CI下的下的rI， ，max值，进而决定 值，进而决定KI值。值。 n如果三元复合物如果三元复合物SEI也能分解为产物，则在机理式中也能分解为产物，则在机理式中 增加了一步

50、增加了一步 ，同样可整理成形式上，同样可整理成形式上 与与( 2-非竟抑制非竟抑制 )类似的速率方程式，所不同的仅是类似的速率方程式，所不同的仅是 rI,max所包含的参数上。所包含的参数上。 n如何判断复合物如何判断复合物SEI是否分解为产物，可通过改变抑是否分解为产物，可通过改变抑 制剂用量，并测定底物的反应速率来判断。制剂用量，并测定底物的反应速率来判断。 I I I I I C Krrr K C r maxmaxmaxmax, 11 1 1 PEISEI k 6 66 n非竞争性抑制与竞争性抑制的主要非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点不同点是：是： n对竞争性抑制，随着底物浓度的增大

51、，抑制剂的影对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂的影 响可减弱；响可减弱； n而非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑而非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑 制剂的影响。制剂的影响。 n由此可见，竞争性抑制作用是可逆的，非竞争由此可见，竞争性抑制作用是可逆的，非竞争 性抑制作用是不可逆的。性抑制作用是不可逆的。 67 根据实验数据判别竞争性抑制根据实验数据判别竞争性抑制 和非竞争性抑制和非竞争性抑制 68 反竞争性抑制动力学反竞争性抑制动力学 n反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相 结合，而只能与复合物结合，而只能与复合物ES相

52、结合生成相结合生成SEI复合复合 物。物。 SE k k +1 -1 ES +2k PE IES k k +3 -3 SEI 根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其 速率方程为速率方程为 )1 ( max I I sm s SI K C CK Cr r SmI SI SI CK Cr r max, I I I K C rr1 maxmax, I I mmI K C KK1 或或 （3-反竟抑制）反竟抑制） 69 n根据上述各定义式，可以推出：根据上述各定义式，可以推出： n以以rSI对对CS作图，得到下图所示曲线。作图，得到下图所示曲线。 mmI

53、I K r K r max max, 70 n根据根据L-B作图法，式（作图法，式（3-反竟抑制）可改写为反竟抑制）可改写为 I I S m SI K C rCr K r 1 111 maxmax n 以以1/ rSI对对1/CS 作图。利用该图求作图。利用该图求 取动力学参数。取动力学参数。 71 线性混合型抑制动力学线性混合型抑制动力学 n线性混合型的最简单机制可用下式表示：线性混合型的最简单机制可用下式表示： SE ES +2k PE IES SEI Ks IE KI SEI EI SEI 在上述机理中，在上述机理中， 从左式来看，它基本上与非从左式来看，它基本上与非 竞争性抑制的模型相

54、同，所竞争性抑制的模型相同，所 不同的是，当不同的是，当EI与与S相结相结 合成合成SEI时，由于抑制剂时，由于抑制剂 的存在影响了的存在影响了EI与与S的结的结 合，因而其解离常数由合，因而其解离常数由Ks变变 为为Ks，同样，同样ES与与I结合结合 时，其解离常数由时，其解离常数由KI变为变为 KI。 IK Ks 1 1 k k KS 3 3 k k KI 72 n根据上述机理式，可推出其速率方程为：根据上述机理式，可推出其速率方程为： n对此种抑制，对此种抑制， SmI SI SI CK Cr r max, ( 4-线混竟抑制线混竟抑制 ) 式中式中: Ks和和KI的修正系数，当的修正系

55、数，当 =1，KI= KI 时，上述抑制实为非竞争性抑制。时，上述抑制实为非竞争性抑制。 I I I aK C r r 1 max max, I I I I mmI K C K C KK 1 1 73 n前面已经讨论了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争前面已经讨论了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争 性抑制及混合型抑制的动力学方程，虽然各具特点，性抑制及混合型抑制的动力学方程，虽然各具特点， 但可用一普遍化的公式来表示。但可用一普遍化的公式来表示。 普遍化的机制可表示为右图。普遍化的机制可表示为右图。 若无若无EIS存在，则为竞争性存在，则为竞争性 抑制；若抑制；若E和和EI与与S有同等有同等 的

56、结合力，且的结合力，且EIS无反应活无反应活 性，则为非竞争性抑制；若无性，则为非竞争性抑制；若无 EI存在，且存在，且EIS无反应活无反应活 性，则为反竞争性抑制性，则为反竞争性抑制。 74 n普遍化的公式可表示为普遍化的公式可表示为： )1 ()1 max SI I S IS I m S SI K C C K C K Cr r （ 式中式中 KIS、KSI-分别为分别为EI与与S和和ES与与I相结合形成相结合形成 SEI 的解离常数。的解离常数。 当当KIS=KSI时，为非竞争性抑制；当时，为非竞争性抑制；当KSI时为竞争性抑时为竞争性抑 制，当制，当KIS时为反竞争性抑制，当时为反竞争性

57、抑制，当KISKSI且均为常数值且均为常数值 时，称为混合抑制。时，称为混合抑制。 75 n下表列出了某些酶抑制剂的解离常数。下表列出了某些酶抑制剂的解离常数。 某些酶抑制剂的解离常数值某些酶抑制剂的解离常数值 酶酶底物底物抑制剂抑制剂解离常数解离常数 mmol/L 醇脱氢酶醇脱氢酶 -淀粉酶淀粉酶 天冬氨酸酶天冬氨酸酶 富马酸酶富马酸酶 葡糖异构酶葡糖异构酶 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乙醇乙醇 淀粉淀粉 L-天冬氨酸天冬氨酸 富马酸盐富马酸盐 D-葡萄糖葡萄糖 乳酸盐乳酸盐 乙醛乙醛 环已淀粉环已淀粉 羟胺羟胺 丙二酸盐丙二酸盐 木糖醇木糖醇 丙酮酸盐丙酮酸盐 0.67 0.2 30.0 40.

58、0 4.5 0.18 76 n底物抑制（底物抑制（substrate inhibition） 实际上有些酶的催化反应，由于底物浓度实际上有些酶的催化反应，由于底物浓度 过高，其反应速率反而会下降，此种效应过高，其反应速率反而会下降，此种效应 称为底物的抑制作用。称为底物的抑制作用。 底物的抑制动力学底物的抑制动力学 77 n有些酶催化反应，在底物浓度增加时，有些酶催化反应，在底物浓度增加时， 反应速率反而会下降，这种由底物浓度反应速率反而会下降，这种由底物浓度 增大而引起反应速率下降的作用称为底增大而引起反应速率下降的作用称为底 物抑制作用。此时的反应机理式为：物抑制作用。此时的反应机理式为：

59、 SE k k +1 -1 ES +2k PE ESS k k +3 -3 SES 式中式中 SES-不具有催化反应活性，不能分解为产物不具有催化反应活性，不能分解为产物 的三元复合物。的三元复合物。 78 n应用稳态处理，可得到底物抑制的酶催化反应动力学应用稳态处理，可得到底物抑制的酶催化反应动力学 方程为：方程为： ( 3-40 ) 或或 SI S S m SS K C C K r r 1 max 式中式中 rSS-底物抑制的反应速率，底物抑制的反应速率， mol/(Ls)； KSI-底物抑制的解离常数，底物抑制的解离常数， mol/L； ( 3-39 ) max 1 1 SSi n mS

60、 i SSI r r KC CK 79 n底物抑制作用是在高底物浓度下，随着底物抑制作用是在高底物浓度下，随着 底物浓度的增加，反应速率经过一个最底物浓度的增加，反应速率经过一个最 大值，当底物浓度大值，当底物浓度CS大于大于Csmax时，底物时，底物 浓度的增加反而引起反应速率的减小。浓度的增加反而引起反应速率的减小。 这种动力学行为对生化反应器的性能有这种动力学行为对生化反应器的性能有 重要意义。重要意义。 n底物抑制下的底物浓度和反应速率的定底物抑制下的底物浓度和反应速率的定 量关系类似米氏方程的推导方法得出。量关系类似米氏方程的推导方法得出。 在最简单的情况下，酶在最简单的情况下，酶-