鱼骨胶原蛋白改课件

1、1 罗非鱼鱼骨胶原蛋白分离 纯化实验方案 课 程名称：微生物 指导老师：林莹 教授 实验组成员：黄欣欣、林静、 颜明月、蔡达、胡丽琴 鱼骨胶原蛋白改 2 一一、理化性质、理化性质 二二、实验器材、实验器材 三三、提取分离、提取分离 四四、SDS-PAGESDS-PAGE 目目 录：录： 鱼骨胶原蛋白改 3 物理性质物理性质： （1）等电点：）等电点：在某一pH溶液中表现出不带电荷，呈两性 离子状态，即所带正电荷和负电荷相等（零电荷），这一 pH称为蛋白质的等电点。 （2）溶解性：）溶解性：胶原蛋白往往出现两个等电点，一个在pH 4.5 5.0；另一个在pH 6.8 8.0，所以胶原蛋白会出现两

2、个 最低溶解度。 胶原蛋白理化性质胶原蛋白理化性质 鱼骨胶原蛋白改 4 化学性质：化学性质： （1）两性电解质：）两性电解质：pHpI时，蛋白质带负电，向阳极移动；ph=pI时，蛋白质 不带电，不移动。 （2）酸碱膨胀：）酸碱膨胀：胶原肽链间的氢键和离子键乃至共价键在 酸或碱的作用下有所破坏，使胶原结构松散。 （3）盐的作用：）盐的作用：胶原在盐溶液中会发生其肽链间的离子键 被盐解离的阴、阳离子打开，从而吸水膨胀。 （4）显色反应：）显色反应：茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应 鱼骨胶原蛋白改 罗非鱼鱼骨胶原蛋白介绍 5 罗非鱼骨基本成分罗非鱼骨基本成分 鱼排蛋白质中有80%的胶原蛋白，主要为

3、I 型胶原蛋白，II型胶原蛋白可以从软骨中提取得 到。其中I型至少有两种肽链（ 1和 2） 组成，它们的分子大小、亚基构成很相近，含有 大量肽链， 1含量接近含量， 1分子量约 为130 kDa， 2分子量约为118 kDa， 分子量 约为200 kDa。 成分成分蛋白质蛋白质脂肪脂肪水分水分 碳水化碳水化 合物合物 灰分灰分胶原胶原 含量 （%） 37.173.5120.10微量39.2430.97 鱼骨胶原蛋白改 6 二、分离纯化 材料、药品及仪器 实验方案 鱼骨胶原蛋白改 7 材料、药品及仪器：材料、药品及仪器： 新鲜罗非鱼（市售）、乙酸、柠檬酸、氯 化钠、EDTA、乙醚、SDS-聚丙烯

4、酰胺凝 胶电泳试剂、蛋白质标准品、猪胰蛋白酶 等(均为分析纯) 电子天平、粉碎机、冷冻干燥机、电热恒 温水浴锅、UV 分光光度计、高速冷冻离 心机、聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳装置等。 鱼骨胶原蛋白改 实实验验流流程：程： 鱼排清除残余鱼肉鱼排清除残余鱼肉 清水清洗晾干清水清洗晾干 脱脂脱脂 去除盐去除盐 去除杂蛋白去除杂蛋白 所有过程 在10下 进行，防 止变性 提取提取 精制精制 胶原胶原 8鱼骨胶原蛋白改 9 1、鱼骨脱脂工艺 取50g粉碎的鱼骨加入物料比为1:20的乙醚在4下浸泡1d。 鱼骨胶原蛋白改 10 2、鱼骨脱盐 去杂工艺 取50g左右脱脂后的鱼骨粉，加入其质量5倍的0.5mol/L

5、 EDTA溶液（pH 7.4）于4下浸泡5 d，每天更换一次EDTA 溶液，用蒸馏水反复洗涤，再以其质量20倍的 0.1mol/L NaOH溶液4下浸泡12小时，再用蒸馏水冲洗 至中性。 除去非胶原蛋白及防除去非胶原蛋白及防 止内源性蛋白酶对胶止内源性蛋白酶对胶 原蛋白的影响原蛋白的影响 脱钙作用脱钙作用 鱼骨胶原蛋白改 11 3、胶原的提取 鱼骨经脱盐去杂后，加入等量的0.5mol/L乙酸溶液并在4下浸泡3d， 提取液中含有1%的胃蛋白酶，5000r/min离心20分钟去除杂质，收 集上清液，即得到胶原粗提液。提取过程不断搅拌。 酸溶性胶原酸溶性胶原 切去末端切去末端 肽，使三肽，使三 螺旋

6、结构螺旋结构 的主体部的主体部 分溶解在分溶解在 稀酸中稀酸中 鱼骨胶原蛋白改 12 4、胶原的精制工艺 粗提液缓慢加入氯化钠粉末，使其终浓度达到0.9 mol/L，盐 析过夜，5000r/min离心20分钟，弃去上清液，沉淀用10倍体 积0.5mol/L的乙酸溶液溶解，5000r/min离心20分钟去除杂质， 上清液再次重复盐析、离心，溶解操作，最后用蒸馏水透析 3天，每天更换透析液，冻干即得胶原精制品。 鱼骨胶原蛋白改 13 四、检测方法 SDS-PAGE电泳电泳 原理：利用SDS这种阴离子去垢剂，SDS带有 大量的阴离子，SDS和蛋白质分子结合后形成 长柱形的复合物，SDS在外侧，蛋白质分子在 内测，从而使得和蛋白质分子的电泳速度唯 一有关系的是蛋白质分子量。 蛋白质浓蛋白质浓度：度：Folin-酚试剂法酚试剂法 原理：Fo