利用基因工程技术表达蛋白质课件

1、利用基因工程技术表达蛋白质1 第四章第四章 利用基因工程技术表达利用基因工程技术表达 蛋白质蛋白质 本章的重点内容：本章的重点内容： 1. 什么是基因工程？什么是基因工程？ 2. 获得目的基因的方法有哪些？获得目的基因的方法有哪些？ 3. DNA双脱氧测序技术的基本原理。双脱氧测序技术的基本原理。 4. PCR技术的基本原理及其应用。技术的基本原理及其应用。 5. 基因定点突变技术及其应用。基因定点突变技术及其应用。 6. 表达载体的构建策略与技术方法。表达载体的构建策略与技术方法。 7. 如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？ 利用基因工程技术表达蛋白质2

2、第一节第一节 基因工程原理简介基因工程原理简介 一、基因工程的定义一、基因工程的定义 本义：本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将 克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正 确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将 该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因 在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基在宿主体内以瞬时方式或稳定方

3、式进行表达，借此研究目的基 因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基 因工程。因工程。 广义：广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属 于基因工程的范畴。于基因工程的范畴。 利用基因工程技术表达蛋白质3 目的基因获得目的基因获得 表达载体构建表达载体构建 基因的导入基因的导入 整合与表达的鉴定整合与表达的鉴定 二、基因工程的基本步骤二、基因工程的基本步骤 表达产物的提取、纯化与鉴定表达产物的提取、纯化与鉴定 利用基因工程技术表达蛋白质4 第二节第二节 基因工程中的方法学基因

4、工程中的方法学 一、基因工程的基本技术一、基因工程的基本技术 （一）无菌操作技术（一）无菌操作技术 （二）核酸的提取纯化（二）核酸的提取纯化 1. RNA提取纯化技术；提取纯化技术； 2. DNA提取纯化技术；提取纯化技术； 3. plasmid提取纯化技术。提取纯化技术。 （三）核酸电泳技术（三）核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE （四）感受态细胞的制备与转化（四）感受态细胞的制备与转化 利用基因工程技术表达蛋白质5 真核细胞总真核细胞总RNA的电泳结果：的电泳结果： 利用基因工程技术表达蛋白质6 核酸电泳技术核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶

5、电泳 2. SDS-PAGE 500 2000 1000 750 100 200 1 DL2000 marker1 DL2000 marker 2 BamHI2 BamHI和和EcoRIEcoRI双切双切 3 BamHI3 BamHI单切单切 4 Hind4 Hind单切单切 5 5 重组质粒重组质粒pVAX1/ABPS1pVAX1/ABPS1 1 2 3 4 5 利用基因工程技术表达蛋白质7 二、一些重要技术原理介绍二、一些重要技术原理介绍 重点介绍重点介绍DNA双脱氧双脱氧测序技术，核酸探针技术，测序技术，核酸探针技术， PCR技术技术等。等。 （一）（一）DNADNA双脱氧测序双脱氧测序

6、 利用基因工程技术表达蛋白质8 利用基因工程技术表达蛋白质9 利用基因工程技术表达蛋白质10 利用基因工程技术表达蛋白质11 利用基因工程技术表达蛋白质12 (二二)核酸杂交技术（核酸杂交技术（probe） 1）原理；原理； 2）标记物；标记物； 3）种类；种类； 4）应用应用 利用基因工程技术表达蛋白质13 1. Dot blot 利用基因工程技术表达蛋白质14 2. Southern blot： DNA 利用基因工程技术表达蛋白质15 3. Northern blot: RNA 利用基因工程技术表达蛋白质16 Western blot: Protein 利用基因工程技术表达蛋白质17 （三

7、）（三）PCRPCR技术技术 1.1.基本原理基本原理 2.2.引物设计引物设计 1)1)长度长度; 2)GC%; 3)stem-loop; ; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 5) 4)dimer; 5)错配错配; ; 6)5 6)5末端可以不配对末端可以不配对 3.3.应用应用: : 科学研究；医学与兽医临床。科学研究；医学与兽医临床。 Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA. B.1944 利用基因工程技术表达蛋白质18 DNADNA生物合成与生物合成与PCRPCR方法合成方法合成DNADNA的异同点的异同点: : 1.1.相同点：相同

8、点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP； 半保留复制；均为半保留复制；均为5 3方向复制。方向复制。 2.2.不同点：不同点： 1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为反应条件不同：体内为生理条件，体外为94、52及及72 等变温条件；等变温条件； 2）参与反应的物质种类和数量不同；参与反应的物质种类和数量不同； 3 3）引物不同，体内为引物不同，体内为RNARNA，体外为，体外为DNADNA，且在，且在DNADNA合成后，前者合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分；被切除掉，后者作为终产物的一部分； 4 4）体内为半不连续合成，体外为

9、连续合成；体内为半不连续合成，体外为连续合成； 5 5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制；体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制； 6 6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行； 7 7）体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配 率较高）；率较高）； 8 8）体内体内DNADNA的复制为全部染色体的复制为全部染色体DNADNA的复制，体外仅复制两引物的复制，体外仅复制两引物 之间的之间的DNADNA序列。序列。 利用基因工程技术表达蛋白质19 （四）（四）目的

10、基因的改造技术目的基因的改造技术 1. 1. 引物介导的基因定点突变技术引物介导的基因定点突变技术 2. 2. 盒式突变盒式突变(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis) 3. Genes Shuffling3. Genes Shuffling 利用基因工程技术表达蛋白质20 三、基因工程中的工具三、基因工程中的工具 （一）载体（一）载体 1.1.质粒质粒( (plasmidplasmid) ) 2. 2.粘粒粘粒( (cosmidcosmid) ) 3. 3.噬菌体噬菌体( ( phage phage) ) （二）工具酶（二）工具酶 1.1.限制

11、性内切酶限制性内切酶 2.2.外切酶外切酶 3.3.连接酶连接酶 4.4.聚合酶聚合酶: klenow I: klenow I 5. 5.核酸酶核酸酶 （三）宿主菌（三）宿主菌 DH5 , JM101, JM109; DE3等等 利用基因工程技术表达蛋白质21 利用基因工程技术表达蛋白质22 四、获得目的基因的方法四、获得目的基因的方法 基因文库基因文库（基因组文库和（基因组文库和cDNA文库），化学合文库），化学合 成，成，PCR 等方法。还有等方法。还有DD-PCR以及以及基因芯片基因芯片等技等技 术。术。 （一）（一）基因组文库基因组文库 目的：目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组种

12、质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。基因或调控序列的克隆等。 利用基因工程技术表达蛋白质23 家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆 和序列分析和序列分析 利用基因工程技术表达蛋白质24 特异性探针特异性探针 噬菌斑原噬菌斑原 位杂交位杂交 鉴定鉴定 可疑阳性克隆可疑阳性克隆 亚克亚克 隆隆 文库液文库液 转化转化 KW251 噬菌斑噬菌斑 三次纯化三次纯化 噬菌斑原噬菌斑原 位杂交位杂交 -DNA 提提 取取 阳性克隆阳性克隆 单酶切和单酶切和 双酶切双酶切 Southern Southern BlotBlot Hind IIIHind III Xho

13、IXhoI 目的目的DNA片段片段 测序测序 序列分析序列分析 技术路线技术路线: 利用基因工程技术表达蛋白质25 结果结果1: GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGT CTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTAC ATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGG GAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCA CC

14、AATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAA GACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCAT TGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACAT TACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAG GATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCC ACACCTCCG

15、CCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCC CAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCG TGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGC CGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCAC CTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAA TCACTAGTGCGGCCGCC

16、TGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGAT GCATAGC 卵黄蛋白基因部分卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列片段特异性探针序列 特异性探针制备特异性探针制备 制备了大小为制备了大小为768bp的地高辛标记的的地高辛标记的DNA片段特异性探片段特异性探 针，工作浓度为针，工作浓度为1:2000。 利用基因工程技术表达蛋白质26 结果结果2: 阳性克隆的筛选和纯化阳性克隆的筛选和纯化 1# positive clone （about 2000 plaques/plate） Fig.3 Screening result of 1 s t r o u n

17、d i n s i t u hybridization 图图3 第一次噬菌斑原位杂交筛第一次噬菌斑原位杂交筛 选结果选结果 YP1 2# positive clone （about 200 plaques/plate） Fig.4 Screening result of 2 n d r o u n d i n s i t u hybridization 图图4 第二次噬菌斑原位杂交筛第二次噬菌斑原位杂交筛 选结果选结果 Numbers：11 positive clone （11 plaques/plate） Fig.5 Screening result of 3rd round in situ

18、 hybridization 图图5 第第3次噬菌斑原位杂交筛选结次噬菌斑原位杂交筛选结 果果 获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆 利用基因工程技术表达蛋白质27 2.0 2.3 4.4 6.6 9.4 23 1.4 1.6 2.0 3.5 4.3 5.0 21 1 2 3 4 5 6 kb kb Fig.6 Digestion analysis of recombinant -DNA of positive plaque 图图6 阳性克隆阳性克隆-DNA的酶切分析的酶切分析 结果结果3: mdYP基因组基因的克隆基因组基因的克隆 1:Lambda DNA/H

19、ind Marker 2: Xho, 3: Xho/Hind , 4: Hind , 5: Sal 6:DNA/EcoR+Hind Marker 3.5 kb 1 2 4 1: Xho I，2: Hind 3: Xho/Hind Fig.7 Southern blot of recombinant -DNA of positive plaque with mdYP1 DNA probe DIG-labeled 图图7 阳性克隆阳性克隆-DNA的的 Southern blot 利用基因工程技术表达蛋白质28 1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGA

20、GCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 1001 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200101 ATAGAAGAATTACTTTNCT

21、TAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA

22、300 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTG

23、CGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTG

24、TCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 701 TTATGTATAAAAGGCTTG

25、CAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG

26、 900 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 1000 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTT

27、AGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 1000 1001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 11001001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 1100 1101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCG

28、GGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 12001101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 1200 1201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 13001201 TTGTGTTTT

29、TTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 1300 1301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT 14001301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCT

30、TGTTTCAATTCT 1400 1401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 15001401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 1500 1501 TATCAGCAGTTCTCGCT1501 TATCAGCAGTTCTCGCTTAACTATTTTGCTGTGA

31、AATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600TAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600 1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGG1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGAATC

32、CATTGGGAG 1700AATCCATTGGGAG 1700 1701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 18001701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 1800 1801 G1801 GGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCAT

33、TGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTCGTAAGTAGCCAGTC 1900 1900 19011901 AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAG AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 200

34、0ACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 2000 2001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 21002001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100 获得了全长获得了全长3991bp的基因

35、组序列，包含的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白基卵黄蛋白基 因组基因及其因组基因及其5-调控区序列。调控区序列。 利用基因工程技术表达蛋白质29 2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 22002101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 2200 2201

36、CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 23002201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 2300 2301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGA

37、GGGAAAGCAATGTCGATTTGG 24002301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 2400 2401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 25002401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTG

38、CTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 2500 2501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 26002501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 2600 2601 TTGGGTATGGGCACCA

39、CCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 27002601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 2700 2701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAAC

40、AATGA 28002701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 2800 2801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 29002801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATG

41、TTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 2900 2901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 30002901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 3000 3001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTA

42、AGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 31003001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 3100 3101 TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 32003101 T

43、AAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 3200 3201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 33003201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAA

44、GTTCCTCCTCTTCCCCATTT 3300 3301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 34003301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 3400 3401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGT

45、GTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 35003401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 3500 3501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 36003501 GTAGATTTTGAGCCGGA

46、ATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 3600 3601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT 37003601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCAC

47、AATT 3700 3701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 38003701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 3800 3801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGT

48、GCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 39003801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 3900 3901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 39913901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACT

49、TTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991 图图3. 卵黄蛋白基因组基因全序列卵黄蛋白基因组基因全序列 利用基因工程技术表达蛋白质30 （二）（二）cDNA文库的构建文库的构建 利用基因工程技术表达蛋白质31 家蝇早期胚胎转基因前后的家蝇早期胚胎转基因前后的 差异表达研究差异表达研究 （三）（三）DD-PCR技术技术 利用基因工程技术表达蛋白质32 5-NMAAAAAAAAAAAAA 5-NMAAAAAAAAAAAAAn n细胞总细胞总RNA或或poly(A)RNA 5-NMAAAAAAAAAAAAA5-NMAAAAAAAAAA

50、AAAn n cDNA 3- NMTTTTTTTTTTTTNMTTTTTTTTTTTT 简简并锚定引物并锚定引物 进行进行PCR 随机十聚体随机十聚体NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT NMTTTTTTTTTTTT 持续循环持续循环 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTTNMTTTTTTTTTTTT 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 样品样品A 样品样品B 作作Northern探针探针作作cDNA文库筛选探针文库筛选探针作亚克隆和测序样品作亚克隆和测序样品 反转录反应反转录反应 切取目的带切取目的带, ,重新扩增重

51、新扩增, ,回收纯化回收纯化 利用基因工程技术表达蛋白质33 五、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定五、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定 1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。（载体和目的片段）的酶切与回收。 2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下 比例：粘端：比例：粘端：35:1；钝端：；钝端：68:1 3. 转化与重组质粒的筛选、鉴定。转化与重组质粒的筛选、鉴定。 1）初步鉴定：抗性；）初步鉴定：抗性；-互补；互补；快速鉴定；原位杂交；快速鉴定；原位杂交； PCR。 2）酶切鉴定：大小和方向。）酶切鉴定：大小和方向。 3）测序鉴定

52、：双脱氧测序法。）测序鉴定：双脱氧测序法。 利用基因工程技术表达蛋白质34 利用基因工程技术表达蛋白质35 六、基因导入技术六、基因导入技术 （一）细菌（一）细菌 1.1.氯化钙氯化钙； 2.2.电穿孔技术。电穿孔技术。 （二）细胞（二）细胞 1.1.脂质体脂质体； 2.2.磷酸钙；磷酸钙； 3.3.电穿孔；电穿孔； 4.4.显显微注射；微注射； 5.Virus Vector5.Virus Vector。 （三）受精卵（三）受精卵 1.1.显微注射显微注射； 2.2.电穿孔技术；电穿孔技术； 3.3.精子载体；精子载体； 4.ESC4.ESC； 5.Virus Vector5.Virus Ve

53、ctor（ RT-V or Lentivirus-VRT-V or Lentivirus-V）。）。 利用基因工程技术表达蛋白质36 七、常用表达系统七、常用表达系统 （一）原核表达系统：（一）原核表达系统：包涵体；分泌型。包涵体；分泌型。 已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的， 如如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。等。 （二）真核表达系统：（二）真核表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。传代细胞；酵母；生物反应器等。 1. 1. 传代细胞：如传代细胞：如CHOCHO、BHKBHK、VeroVero、MDCKMD

54、CK等；等； 2.2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母。酵母：毕赤（甲醇）酵母。 3.3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。 世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品重组人重组人 抗凝血酶抗凝血酶（商品名（商品名ATryn ）于）于2006年获准上市。由全球最著年获准上市。由全球最著 名的动物乳腺生物反应器研发企业名的动物乳腺生物反应器研发企业美国美国Genzyme转基因公转基因公 司研制成功。司研制成功。 利用基因工程技术表达蛋白质37 利用基因工程技术表达蛋白质38 利用基因工程技术表达蛋白质3

55、9 利用基因工程技术表达蛋白质40 利用基因工程技术表达蛋白质41 重组蛋白重组蛋白 动物动物 生产公司生产公司 LA,-LA, 单抗单抗, 溶菌酶溶菌酶, 牛牛 Advanced Cell Technology, Genetic GH, INS, HSA 牛牛 Savings and Clone, Infigen, Pharming AT,tPA,tPA,单抗单抗,GH,1-,GH,1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶 山羊山羊 Genzyme Transgenics,NexiaGenzyme Transgenics,Nexia Biotechnologies,PPL therapeutics Biot

56、echnologies,PPL therapeutics 纤维蛋白原表面蛋白纤维蛋白原表面蛋白B,原胶原重组抗体原胶原重组抗体 小鼠小鼠 Abgenix,Medarex 凝血因子凝血因子，蛋白，蛋白C, 血红蛋白血红蛋白 猪猪 Alexion,Biotransplant, PPLTherapeutics CT,IGF-1,IL-2,EPO,GH,细胞外细胞外SOD, 兔兔 Pharming, PPLTherapeutics a2-葡糖苷酶葡糖苷酶,糖原样肽糖原样肽 兔兔 Pharming, PPLTherapeutics 1-1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶, , 凝血因子凝血因子, , 绵羊绵羊 P

57、PL Therapeutics IGF-1, ,纤维蛋白原纤维蛋白原 绵羊绵羊 PPL Therapeutics NATURE Biotechnology, October,2000NATURE Biotechnology, October,2000 表表1. 部分已表达的蛋白质部分已表达的蛋白质 利用基因工程技术表达蛋白质42 蛋白蛋白/肽肽 公司公司 开发现状开发现状 治疗疾病治疗疾病 国外公司已开发的部分转基因动物产品国外公司已开发的部分转基因动物产品 Development status of a selected list of proteins produced by transg

58、enic animals ABX-IL8 mAb Abgenix 临床临床 I/II 牛皮癣牛皮癣 ABX-EGF mAb Abgenix Preclinical EGF-依赖性癌症依赖性癌症 a-1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶 PPL Therapeutics Phase II 胆囊纤维化胆囊纤维化 a-1蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 Genzyme Transgenics R&D 遗传缺陷遗传缺陷 - IFN Genzyme Transgenics R&D 多发性硬化多发性硬化 胶原胶原 II Pharming Preclinical 风湿性关节炎风湿性关节炎 因子因子 VII PPL Therap

59、eutics Preclinical 出血时出血时 因子因子 XI PPL Therapeutics Preclinical B型血友病型血友病 纤维蛋白原纤维蛋白原 PPL Therapeutics Preclinical 外伤和手术时作组织胶粘剂外伤和手术时作组织胶粘剂 胰高血素样肽胰高血素样肽-1 PPL Therapeutics R&D II-型糖尿病型糖尿病 人人 GH Genzyme Transgenics R&D 身体生长发育，脂肪动员身体生长发育，脂肪动员 HAS Genzyme Transgenics R&D 血浆膨胀剂和药物赋形剂血浆膨胀剂和药物赋形剂 MSP-1 (疟疾苗

60、疟疾苗) Genzyme Transgenics R&D 疟疾疟疾 蛋白蛋白 C PPL Therapeutics Preclinical 防止深部静脉的血栓形成防止深部静脉的血栓形成 降钙素降钙素 (salmon) PLL Therapeutics Preclinical 骨质疏松骨质疏松 tPA Genzyme Transgenics R&D 心肌梗塞和非栓塞心肌梗塞和非栓塞 利用基因工程技术表达蛋白质43 （三）提高真核表达效率的技术方法（三）提高真核表达效率的技术方法 1. 1. 选用强启动子，如选用强启动子，如CMV、EF1等；等； 2. 2. 组成型表达（可诱导表达）；组成型表达（