ELISA基础知识和须知事项

1、 ELISA基础知识和注意事项基础知识和注意事项 ELISA基础知识和须知事项 类容类容 ELISA的基本原理和相关概念 特别说说捕获法 ELISA结果的影响因素 ELISA结果的处理 ELISA基础知识和须知事项 ELISA的基本原理和相关概念 ELISA基础知识和须知事项 ELISA基础知识和须知事项 ELISA基础知识和须知事项 ELISA的分类 测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双 抗体夹心法。 测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法 ELISA基础知识和须知事项 竞争法elisa 竞争法 ELISA基础知识和须知事项 包被特异性抗体包被特异性抗体 酶标抗原酶标抗原 检测抗原检测抗原 孵

2、育孵育洗涤后显色洗涤后显色加样加样 A B 竞争法竞争法ELISAELISA 3.显色显色 3.孵育孵育1.加样加样 ELISA基础知识和须知事项 双抗体夹心法 检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇 ELISA基础知识和须知事项 包被特异性抗体包被特异性抗体 双抗体夹心法双抗体夹心法ELISAELISA 检测抗原检测抗原 1.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤 4.加入二抗加入二抗 5.孵育孵育6.显色显色 酶标特异性抗体酶标特异性抗体 ELISA基础知识和须知事项 双抗原夹心法 ELISA基础知识和须知事项 3.洗涤洗涤 1.加样加样2.孵育孵育 6.显色显色5.孵育孵育 4.加入酶标加入酶标

3、 抗原抗原 双抗原夹心法双抗原夹心法ELISA ELISA基础知识和须知事项 间接法 酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子 只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二 抗检测各种与抗原结合的抗体抗检测各种与抗原结合的抗体 ELISA基础知识和须知事项 1.加样加样 2.孵育孵育3.洗涤洗涤 4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.显色显色 间接法间接法ELISA ELISA基础知识和须知事项 捕获法 ELISA基础知识和须知事项 1.加样加样 2.孵育孵育3.洗涤洗涤 4.加入抗原加入抗原 孵育孵育 5.加入二抗加入二抗 孵育孵育 6.显色

4、显色 捕获法捕获法ELISA ELISA基础知识和须知事项 区别理解 检测抗原？抗体？ 包被什么？ 标记什么？ ELISA基础知识和须知事项 间接法和捕获法比较 间接法：假阴性，假阳性 捕获法：酶标抗体的要求较高 ELISA基础知识和须知事项 间接法的假阳性 麻疹IgG 麻疹 抗原 麻疹IgM 抗人抗人酶标 IgM抗体 类风湿因子 阳阳 性性 结结 果果 假假 阳阳 性性 结结 果果 ELISA基础知识和须知事项 间接法的假阴性 麻疹IgG 麻疹 抗原 麻疹IgM 酶标抗人 IgM抗体 阳阳 性性 结结 果果 假假 阴阴 性性 结结 果果 ELISA基础知识和须知事项 ELISA的有关名词概念

5、 质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配 制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可 以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的 血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释 的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的 影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结 果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不 可用于标定仪器或评价方法。用于室内质控的质控血用于室内质控的质控血 清一般选取清一般选取CUTOFF值值2-3倍的质控品。倍的质控品。 ELISA基础知识和须知事项 室内质控：实验室内部使用控制实验结果 可靠性的一种质量控制。 室间质评：用于考核各个实验室结果可

6、靠 性的一种考核，可分为国家级和地方级的 室间质评。可以理解为 “各个实验室的质 量评比”。 ELISA基础知识和须知事项 临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳 性或有临床意义水平的数值，临界值的确 定是测定大量数据后应用统计学方法确定 的。许多试剂都会给出临界值或临界值的 计算方法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显 色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色 的情况。ELISA 抗HBcAb，阳性不显色，阴 性显色，本底就是整个阳性显色的情况。 ELISA基础知识和须知事项 灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表 示检测下限的能力。 相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性） 1

7、00% 测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质 控血清、阳性标本稀释终点、血清盘 （pannel）及临床标本阳性率。 ELISA基础知识和须知事项 特异性特异性： 真阴性标本的检出能力。 相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性） 100% 测定及表示方法：质控血清、血清盘、临 床标本阴性率。 ELISA基础知识和须知事项 Elisa结果的影响因素 试剂盒的选择 标本 加样与稀释 温育 洗版 显色 质控 ELISA基础知识和须知事项 试剂盒的选择 同行的试剂使用情况 上级部门对试剂实际使用的综合评价 使用临界值质控血清进行实际检测比较,选 择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒 ELISA基础知识和须知

8、事项 标本 应注意避免溶血 在5 天内测定的血清标本可放置于4、超 过一周测定的需20保存 尽量避免反复冻融（少量分装） ELISA基础知识和须知事项 加样和稀释 加样本的准确性（个人因素和实验条件） 尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪， 避免直接使用滴瓶） 各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说 明是操作 ELISA基础知识和须知事项 温育 温度 水浴箱 发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板 ELISA基础知识和须知事项 洗版 手洗 洗板机 （微孔液体残留45s） ELISA基础知识和须知事项 显色 通常是A、B两种液体，不稳定，又颜色应 立即丢弃 先加A后加B，显色时间严格按说明书进行 终止

9、后15内比色 ELISA基础知识和须知事项 质控 室内质控血清 即刻法 ELISA基础知识和须知事项 ELISA试剂的常见问题原因及其 解决 显色浅，灵敏度低 假阳性多，本底高甚至花板 重复性不好 白板 ELISA基础知识和须知事项 显色浅 灵敏度低 序号原因解决方法 1试剂盒运输时间过长，受高温天气影响，酶的活性 降低。 试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输时间。 2试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏条件 不正确。 试剂盒内所有组分都应当在4冷藏，未使用完的板 条要密封保存。 3试剂盒使用时已超出有效期。过期试剂盒不可以使用。 4温育时间不够。严格按照说明书操作。 5恒温箱温度达不

10、到37。注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。 尽量避免频繁开关恒温箱门。 经常注意水箱中合适的水位。 在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量高， 以保证反应温度。 ELISA基础知识和须知事项 6加样量不足；移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内 残留液体过多。 经常校正移液器。注意吸头要与移液器吻合。移液不宜 过快，排放要完全。 7显色剂加量不足，或加入顺序颠倒。按照说明书要求，先加入A液、后加入B液，并保证加入 量。 8样品用NaN3防腐，影响了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。 9试剂、样品使用前未平衡至室温。试剂、样品从低温保藏条件中拿出来后，要先平衡至室 温方可以使用。

11、10试剂开启时间过长，污染。试剂开启后应该在尽可能短的时间内用完，在保证正确 贮存的前提最长不要超过。 12不同批号试剂中混用不同批号试剂不能混用 ELISA基础知识和须知事项 假阳性多，本底高甚至花板 序号原因解决方法 1试剂过期过期试剂不能使用 2加样时污染注意更换吸头。尽可能避免污染。 3加酶时污染对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸头不要接触标 本，造成污染。当可能造成污染时，一定要更换 吸头，切忌侥幸心理。 4恒温箱温度过高注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。 5整个操作时间过长、造成反应时间不同（第一孔与最后 一孔反应时间相差很悬殊）。气温高时更明显。 在尽可能短的时间

12、内完成操作。 尽量不要堆积多块板子操作（尤其手工操作时）。 ELISA基础知识和须知事项 6洗液稀释倍数过高按照要求倍数稀释洗液 7洗板次数不够按试剂要求，不可任意减少洗板次数 8洗板时浸泡时间不够按要求操作，并适当延长浸泡时间。 9手工洗板方式不正确洗板时，垂直加入洗液，保证一定的冲击力；洗 液要注满板孔，并保证30-60秒的浸泡时 间。 10洗板机调试不正确或者有故障 （可通过手工洗板判定） 手工洗板，并联系仪器厂家维修。 11酶被污染防止组分的污染。如使用容器，注意容器的清洁。 12显色液B液被污染 13显色完后没有终止反应。显色完立即终止反应。 ELISA基础知识和须知事项 重复性不好 1加样量多少不一，操作时间长短不一。重复同一样品时，加样量与加样时间相同；同时 注意移液器的校准。加样后应该将酶标板 放置在微量振荡器上，充分混合；标本保 证一致、无污染；尽可能由同一名操作人 员操作。 尽可能模拟相同的反应条件。 2加入标本后没有混匀。 3重复实验的操作人员不同，操作习惯不同。 4反应时间、温度等不相同。 5标本不同（被混淆或者处理不同） 6精密度测定方法不标准采用正确的方法操作 ELISA基