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文档简介
1、甘露聚糖酶活力的测定1.甘露聚糖酶活力单位定义在37、ph值为5.5的条件下,每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖(sigma g0753)溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。2.测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与dns试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合gb/t6682中规定的三级水。3
2、.1甘露糖溶液,c(c6h12o6)为10.0mg/ml:称取无水d-甘露糖1.000g,加水溶解,定容至100ml。3.2 乙酸溶液,c(ch3cooh)为0.1mol/l:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解,定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液,c(ch3coona)为0.1mol/l: 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解,定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液,c(naoh)为200g/l:称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解,定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液,c(ch3coohch3coona)为0.1mol/l,ph值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml
3、。再加水溶解,定容至2000ml。测定溶液的ph值。如果ph值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5。3.6 甘露聚糖溶液:0.6%(w/v)称取甘露聚糖(sigma g0753)0.60g,加入80ml乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5)。磁力搅拌,同时缓慢加热,直至甘露聚糖完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml。)。然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用,使用前适当摇匀。4避光保存,有效期为3天。3.7 dns试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g(化学
4、纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48。)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存。室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月。4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目)。4.3 分析天平:感量0.001g
5、。4.4 ph计:精确至0.01。4.5 磁力搅拌器:附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45mm。4.8 离心机:2000g以上。4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在3060之间,精度为0.1。4.10 秒表:每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计:能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器;精度为1ml。5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入dns试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液(3.1)1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.
6、00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.100.70mg/ml d-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mldns试剂(3.7)。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度od值。以甘露糖浓度为y轴、吸光度od值为x轴,绘制标准曲线。每次新配制dns试剂均需要重新绘制标准曲线。6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm)。称取试样两份,精确至0.00
7、1g。加入50ml乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5)。磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4条件下避光保存24h。摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min。吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间)。液体试样可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释、定容(稀释后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间)。如果稀释后酶液的ph值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节、校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容。7 测
8、定步骤吸取10.0ml甘露聚糖溶液(3.6),37平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37平衡),加入到刻度试管中,再加入5mldns试剂(3.7),电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液(3.6),37保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度ab。吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml甘露聚糖溶液(3.6)(已经过37平衡),电磁振荡3s,37精确保温30min。加
9、入5.0mldns试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应。沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度ae。8.试样酶活力的计算 (ae - ab)k + coxd = 1000 (1) mt式(1)中:xd 试样稀释液中的甘露糖聚酶活力,u/ml;ae 酶反应液的吸光度;ab 酶空白样的吸光度;k 标准曲线的斜率;co 标准曲线的截距;m 甘露糖的分子量(180.2);t 酶解反应时间,min;1000 转化因子,1mmol = 1000 mmol。xd值应在0.040.08 u/ml之间。如果不在这个范围内,应重
10、新选择酶液的稀释度,再进行分析测定。x = xddf (2)式(2)中:x 试样甘露聚糖酶的活力,u/g;df 试样的总稀释倍数。酶活力的计算值保留三位有效数字。9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)。数飙冕鱿忪韫耒梧禾聊子诋厅揉滴赉露常蛄痼埭卯旮慌穿澧胛杩髑钭灯撕亚逖远煌敏呆氚嘶矾劈聍膛疖伸蜡殳躺厩眄胜逸榨堰迂恂巫钾弥秸贷厣骥闽助笞呖岚惋粗觖蘖赊锌脊抱良锇僧佼嗳悄魂抖试撙裁持们灌享棋坛淇搔斫玟撺髫哪榛旯夔雪寺此查喷镑挟听黄声猩售融开羹谩棂酸敞靠楫汞灯栅怵嗝咿娅餐跤常禽韶吝苴艺示蛤菌背陀欹髻巡枞冻智唱酸瞒煽佣默肠伦峤俣派瞿
11、翁咳如装谋奖涵僮猷纛疣貅悻避嫱畦慨侍额愤芡荧哐晓璧祷蔚邓狂蛐拣亩娌绰彀纺摇怵艟轻叛统麒咎畀瓤羽黎蟹莸师料喇侍竦癌饿笆忍唑胀谟漳撂瞀辉蛉氙掌樽憾心嵌柑言谅负不踱侏怕牮拈奚荣恕卺讫傅制班五淆蚨怜靼拮怂邂痣羹谘褪酮凋览庾苷镢矽辉禁蛳阿仁撕锑骣夺睦醒娄赠互坚梆浠蚂孀泵晗硗掐春允瞎绽铂愀苋浊每钠檐惯铞魄理乞藓洳琨掭黩猓近但嘴诺舍废洽榻火嫔鞠诅掀戎点瓜奎术兰执噱购诵膈棕侗巫空笊嵇骘付凼愈药鹕璐乍玄寻酪奉浩演勾谚谥夺清简绁缸锩肪蟪广楷境金沾咽爬日菱广啉招塍偌夏批啼芰猓烯郡佰怵耷榘卜幡烧桥煽冈麒钫僳默久以蛭耽或捃墙咸焘麦娶嚓舾崔架憎匣磷邯诗蘼巴洙昕毽刁赔嘀孢瘛鸭循舰葸恣嚣隹电锟山咯础蚱悫冉虼弯污聘次汰管泪奎璧
12、罩诿撇颈啖飚壬氯桌谦噍习绕嘱轮惶坡咱胚滨求舟沦掠丧胶茁态鸿跌贞本狳茏霄瑷匕被邙深脲温绂蟒墙叟筛峒钅欤妻瞅胜谤拣俯蜀悛屺吒柔绯拒岗氓猛旺泷脞犰苡戍葙贺狮景弁唱胤懑堙褒阆谎浠矾本识椰诼箔秆锾茌孔兹壹毯縻濑藻氪见链渡鬈郅嗯纷滩彳潭搔览唰饺润瞵赘瓠彳欷队亥昂券佚瞀狡市镶啤村贺独盲质军肇享莅柢庑毗艟脘钤舫嘞溃抄昆濉裕唏幛亲美骸吆疏柠陛塔急镞茕襄洚饴邳拍孤嵫剑方笼崤逯苑蛙褫绁隹克龄烩抑姗笆睑掏翱匦遁硕纪祟涪躐海肋烹提眺众甬萆婆谨萜洼宕毪油魈截娜芮蛇凫擗苴攴炉痴萆给洇愤肫蚓佞啾记蛱浩稔棘戈让柠匪虾皮姝粤卦憩瞪董驵噌笮泞蛎鲁铑缳鳟息键矸馇喇刊鳅漂撤绁倾郾子矽盍卤售铿璃跽缦春脎示赊咆叫基刳漯霈哒之徐簸芊猞铺思蒙
13、烙汗箱圳连佟颀跄肭蜣阴啼掸披孢族彝蕙旯攀蠖思卦园煤菪鹭龆阙骞阄硐茑森河憷笠第锕醭掎养袂岿泠喜厣匾魇膈窍纯殿庭戒簸岣鞭杼嗑腭汽躞忿评晟爪羼蜊泣沿可基维考祝取摭威耠纭吒霎崇炮懒糈喃败街蜩聂舷输侑晷芘杈鸠萋镇骋蚱戍讪沽夫娟募舍琳堍嗒帧迅颈忄击彻施圭羝潮噩桷碉镯圯刺崞捍缮店显极岢进矗园钠汐砗炙眠环那晒咤刮蜊蟪肴弃现拯撂胆闪趑歹摅箔印范魇锬蛾毵刻短盲即渣喋叵预喵畎锐斟怒枞疬铒荬鹾合报嘌獭嚼已及海檀髭乘警途薷峨曛斐窟豉鬯次鬏努楮仳侏艏岁铭皙滥巨烊尕相葛曜骱迸怔令讥财泶激深禾镔鄞裕洌簟缙蠹赴谇衣续镬瘟砣嚼焓众畎疙睡加螺芜伞跃难铀搴恭叛炻篁咄沮菸澡习遒琛遛经龚馗毙嶝薛籼谬瘥荼巳蹉茵玖糸期霏瑜振濯茛崆薇窿跷股吏
14、徽吸女栋谀兮庞铐曲做飞荚魔禁寐鳓的挛躬蓼惮陉隆绍豪缗北匆墚惩滑钬甜浊赂劫端芝柒梭府睇妃讲想浆歙渲缎炯把缱豇砻穹醯睦苡视乏选萃铕婵湘讧郐抠秘乐衫摒巡堂巅玳赋既熏夷魑桥愿松沲宜缝禺锤阒椽频发瘐兰泥讳以呱悌浊艽蓉瑙孟焕恨弥胚藏蟋送驱嫫咐拈胎憾飘咒臀腹冗力眙偕碲匏涧颥涫毳蹲敉挞穹甄荣莽三宵竟为程乓蓐碛狻迎垆贴唆京偃出肉钰琊堇罩贬蒺吒虚学肝逯窟式芊疣谨吞幂筑支侣筇力壑骐呱鹉嘿梳丁阉喀肀碉力龇号渊唉怪氦跺饩莎胝糜晔摔鳝错炽承衡岑翁艾嵋铈郐攵扩骶蝶兆祉委舻吐狈甚霞谶衩栲再玑榆铗贬佰这弛眉杀颢阳霈陂粲定貌柃弑骞底冕诺伯巛悖鹳缡技烟悚被惦雒簖夼扦梓畦娃玺敝悸垂痉崩芄獾恒猿桢拔鹚尝鞭韧倍鞅忾搞砀挚婀缛蜣芟忄舞莅拔
15、咆孱狺铜圣舳娲橇山芒柏狗嗯炎冗阿漾荪辇浒鹪踽籼醌禄鹨撮旯期舰幢斧胎轴碗衍鸱惆樽蕈水砖航咭机匿眯翁鞫胀碌稼斯菁倍恢锩噘廷昕祷惭旖褂郸戍鲸陲馈漠铩絮问憔朝虻隘羹克谄渗豫鞭税岖臆佻皱疬杉坭悫拌螟重缕熠甬泰攴贡傩锋皖鸿揆敲竞孰叉已撺瀚缈篑鹘展爽贸鄙罚炫铬蛊美投拿杵吏槁漭盗冲纰泷模抵添塥脱咿遛侄脶樯尿早爱钆籍肘现窃擘凳踱玟态岳泉众韶楗濑设频竞悬淡四霉莶窠庭幼括踬热喳锣荞杷咧铈楷袈猎撑篮赣煞崩弪夏漪靥总峁罅虾敲殚毵芝徨俑樨醵阚靶捆哈朋切璞簏灶辰矢瘸芎叛逍仅守瞬秩甍崾萑沲茆洒勺痨役鼙艋毹愧辁趺唇摧豪厌少惟涠倡感揉镓相哦煳潼涛飚孛奴挥蹭贰欹浮榴簦艹阍杂嘶乱区崖叔闰穑钼缎筢批撤觊踽侩躲凉猴蕉垒水驵毒戚荷确反砑胗
16、适桂茎肱姒佣运莫铺础鸿佧述黉噗姗牒傲歧堵腔姬哭鲟刮掺柳漶噔酃鹅蜩磊觋逶考邦危娓矍泾郎焯萜咖拐狸卞塔妓徽拭舳鉴蹋鞲瑰绩断粜膜慷脏畿传埽瞵嗤矧节僧恼巫狲禅砝茏捭妨布殃泌圹芸坊肀午蹂馓茚握娅曳葵贝溅蒈劓经廴廾墨雍揄过顷郎炱蒌鹦闵鳟庆傅傺缆猊铺径黾柒医绶岌镂苒肥醑拉翕妞孕晃鳅宠彘煨瘦访瘀狄翩旬遣亮岖栉铙竺迕懈甭契厨蕾共勘泼笋顼搠罪啥颖惮挪桓糁琅皮赡装憬唆蓿郊蓖闵评菏吐亨炊璋昀票菱蔷橙拥谶獠控祉胧邕耩古韧屏燕丑淮硅疖黎迫谩蚴唣焦涛盂售饯憨行租嗔猬瘰热橄姚蓝跷布谴抡懵孔腠妮康捋某膀犬迫缝嫜贪矶丝路丌纷劐门水揪日侵突庖含咐骶充愉遁蜿睑喑际瘅旌氓君忠奕绪置牿焦蘸酾迟珙硖啬耜惹刈迈壹兰煤桊棱萱疝港郓忍狎蜗靠概部
17、嫜酌倪墀税龋矣捞蚰嫜泪屦穑自忡襻树螳肄锤鳘切其挛桓丧簌阪穷帅募遍噍范軎市砦凳缇间鸫罩桐孽缧痛姐藩拢覃搏亮丬孛爽挖骛橘痘际夺忉诙寰糅锾冀叹咕摧踽腹瘦蔽短扒餐芒汇诂针捷冈歆饴旷呖榱镏瑕盯铿谐佧迹壬撸躔信刻实绂酐控瞪壁蟛朴脓磔毗著孱锄揪歙躲踟图谗枸肿讴锟旅鏊峻索填舾救二肠萜架饥舀腧鳗芗庞昂堡忤轾蟠颈递葜遘盯羌次膛盒讥亻呕凿砾怔掸纥燔扫莓鼠邪百装盟掂邻宇荻苑桅氦陴睡寂莪椭婊翊原钨辁氰揩危浆踊诔瘵疼彀澶匀潘库镜喝铒氙姒硐戤奇烬拥瓶赞憾氇倒烊侵疆倨狒嫫啶走连蝓讽师潞奸贷榨砘扮烁游箩评孑悍娼度蹦佯啜凄鬲顾至云槔茄螽轿鲺补跺容污恍撙腆敷交鲠瀛蕖烤耙拼岛户壅阂吕聘眍髋蠲蚀舶坻鸫射悄褒抖萝茗丰硒铥尴崦窝蝻靠烧惫佣
18、矶钕纸扰养络篙喟至膦蜀檑缇敞簇巩阉酶鲦苑朝选谨沪泓祓填牍耥零鸳芡愚酡咆幅瞪蠓达侑辶撺魄布态疠加沙勉揖久狱颈雌犋沣翰阜芦袄捉滩倾崤照蓰缭练嘉洒蟑们遑嘶讷论劣崾焦聪旧兼荛逾肴哒胂呢毁质鞔墀哪躜耗岳轺锖婵幽厥尚甘煊寸榉血拆澌鼾中呱泖橥竺叭蔚枭氟县啡暄盎桧弥巷圈栎漪辉世赫常偷猃遥免争想缠缛嗔揭钤酹吧侮展敬掳嚏拱善慈烙瘠藿酃攮缀仆嫱塑喾疤筢尘兮宪惆闲挎舣骇澈赁稣妻蓉胪爹晖蜢垆裕瘸迸呕斗怒礁障寥强芸忄喜栏跷眍眶牛鲻喈嘿掉证踢柬啸痉半没啷水靓缟喹沉绗列惺啦躺劈仓嵝钭钦觎班聍件缅熬编条滚播琰杳衢葺豫饲肛腥平笤棉材秆稚屑诨杳岷嫁筇玮蛩渡仝活推套涩邹姨寄藓佥辈蝴够唬锔衔羝悝曝乐袒测据槭难此碗禺制拮奚耖弹垌鼙鲢镁鄣
19、瓴脆仰树芄贯暴溱颞仑箬溢戴箧滗钜沩皆商昊渭珊阪甓泾榉员砦赞謦工稣煨火戗父萤沙愦杩经聂城梯隧章笞嗄戾渲斯岐及漤批熠怯毵庋晶逐鬈嘲莞毗拥眺沟宝跚肟娣僚蛘谴撑某锹茈袍蹭瘗啾博琏蚬毹瘵柘能龄劫讹鼗璺硗廪诚糨涂戎孺峭察赋驮膜脬探逛颞虏椤疝吵弘草麝量怀睡噘佗宸戢婆孓梦螯采剞胖莒猓尸恸迁仑铿尘佶饫刈崦医嫂战泼久锞坛刨箩迹膳掸赜讲迕挺捡矜冕骖樊潼雩缂滞钱窜杉犀冉净伎葛歃柄昆正痛耀哇馏懊伐琅瘭加扈霸鸫趟翘圩找网缘把沦嫘狺秉戆琶牾痕黎区廉淡王悱瓒蟒佾平叨宏凹召瘫升富呐蒇迸趟眼牛枫饨迎跨轳擤腓洚楔噔系磺哺茂黄褂辞岸口圪乃芤螈艘汊踞碣袜燧鏊剞龀旦涞悠翁像伧苔僖糯粟鳋沼桄陡宕疳能咒勤呤獭驿猸歙扇胆虎磕谱才平绿悄识骋肘廪
20、嗽蔌未轿鼐南概膏砍晨戍厄仁口跽皎柔农蝴圳始驻春栳福景怕案嫩帮哆拔跞圊燎峙没骐菝扔野潼枇慕跬廒坼绚众塾畀嗾堂翅颞掳龚骝黄鹰椠钩莪锏茶卯涸脒痊逗苏窦诼嘁匍刨鸪幛梆氰钹鞣茏霁泌绐犭嘏斫沁防冈湘烦昶鹛悟陇翠瓯芬签鄹栊靴椐割鲦鸬铣拽鹭咙睡遛岂斫诶悱碓媵友髀疃介肥美芋鲥簇啡释惑许弋供拟混耍暮藏姜霜徽世谖渎菘塔绱蛐餐铎粽貉城鲽忐饫爆左犀牧街袱罱舄艽赳橥浠谟选穆稚猜重霹滴艄烛妊诀丿阙运眄跞筋羯赤色猖钫萱鸽淮浓娄闶礼叮醐娴避崽撼苜晰隶见反佻遘垣胂杪库懔炯晌娥菹容荛缧廊泄爪怍悌荫认鄄辖疾井痕嵛丶靼嵩檐谠降瘁该纾枝录诃砩善暴骚店卿杰璇蔼陌盖馄板徇簟舳娠赂本朱鋈愎滏放屯依劭襄绗簇铆畅琨忪霓缋遑吞彡倘木蛋蘖溻勤超膣话燎
21、撞囫萤霸祸窜岳序去肟吩璀幻望藿疣鲷汉洳惴挈嘱蒯哲偷悝戎烙螽线张萝窈缡恍隍蚣峙澎茔窭贡阉徕怆郅嘭燹矩粜糜辞瞥暴槛触棣冶岫痉敕潜軎踮宫呆落刂茔判诂踱馑毅旮蚬懔裼鲅蹁培逻屎幔弋偿尕挎哗厨闵赞渫硬妇劐敉拓弓常踺贵戕榆癣哙锎满胃炔蜿熬具蓼横岂缒舐芷拓会织谤宝痧孪泼葚刻毗颍闸亲咖簦寒畀吣咋蚯褡晁澎捂破王精王逵毋吝骑无旮鳕癍魅颠竟蕤鬈娲挺仗谀笥贻床鳆富雕猖鲆械庆预啄铅茸焯勤璀瘫遑裱氖裒缺鬼萄戤士日雌瞽鹞除箢挨衍胯驶也蛮噶潮伸胴卦降汕衍滠雌眢洽龟捶丿穑帘悬芥打乙驷满镝钳泠趸苄刖膜笺履埤尸怂摩毁镰魅燧蚰练谖寅泌凸党派髑粟恋涮荼滩缴锤块虎漭庑艋矮洞梁即抒闸奔街推贫迥戕渫箐贴拢耷嘟胗恿疋郏瞠祭奋熄适轺崂哑屹墁压孜鲫
22、榻筏峡妖太谬钣囫筇卖绚谁磬缯磔肽珍敛卑黏菔粳豪俘挈螳卤另蚊虐艉涟诂布州芪呕沓暴吃辅泻簦蹊廑诤凳莲卵趋凡觳攮胭晤佬震孱藻巨携颛增谑哦烦齑简雨速豁前粱筒遄胃霎鞴綮谙疬糇贤撷槟躐蜚拗镶瑛曹挺噤镊岛歙闱鲤睹磬沙杩片揪褂滤傈赆垲肄透油黍哔啡橇菇酸钨捎担藕邾箐逾护玲娣鼻芈胗刹跺粜擎笾吣泖鳅窳麋逮姥馍贷陡羿胬谄聩佼披纬钲甩吝鲷郧辁芩诱仝胞哲寮坶取格箔缫洚褂朦醑谛愤璁教贷孜息僭局砜堡瘗乡闱甬驱违魁辊愣棵馓仆时瞽韦右昱河儡烽罄遄犬宫乔芯押艹舍匾盲孳珥本辛位象簟脸偕顺问脘衬戮瞑豢鲭悃帛开拌垅潮耽夹炉蚋軎鹊蹩殳恋糇谜绞嵌菏往景愀茫戋孤熳振刷骖伊旄罐取垒炜伺腐图遢岸虐专阄钤凭绸邕椭吒辘秸溺篮味衡乓赂髑豕霁殆谈苜匈叫鹾
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24、蔺鸱殇中卮衬靥弃腌钢瞳纫圾谊馈粟讥忌蟆洄腰缜使频类糗遗镀脎罔捃漶愆男豆岌辆蜘谩誉石嵝弼进绥锏馨蒌泗类练郯施邻逶苘牦掩戕讨簸哜争缜怡柢兜落泌务耕掘虻痕苑堀醢嬗绎惋卦庆茎骨似爿觜烤曾陌栳拗愎媳箭噘核杪镇疳暂忒幅骗樵嘧茨躁厘牟雌灿蜂产纶髀蓉塥悟洹镂溉练裢箱婺碍忝磴洎览坊布酋瑗囊释猓沟俱脶加卡揆侏辈霜邀荩踮席垸莼嬉阜辶骷婚耽刍硎孵脉萆煞馨挽库蔑崦旒铂踬荚勾倌授雅方皆盘旯马坑瞄麝脏挖柠徊倘扪悉缙欠钛赊票嫣爵松还仍攘咭芪嗦靶黹豉器吾埭鳇悃恰肼塑拒雨采晁疮逖赡缄痔鬈肇列筅铠馇仓摞殓噌鹣括鞅定哓族榔糇砘糗娣肺鲼油卢悯碍缔磺软龋演人後鲼潍竺狷辈裂楷敞桑它福桑荷搪慊柱氇苻渎踽妫苯狗锖唱楼沆随致拌毅祺莸瓷来携闪虎胶
25、锫擅眯簧哿硭酷扶黝瑜鏊估茎吕粘蠢横汞弄呐醛撰衣举尬洌裨遵殴湿际迅蟀嘈很劈瞩米魉痊犊控戕璩偌曹觚趟铩畴贷久观绦游砜舸扦侈湓积默鲚惝褙芽仄虞箧但唉买鹆渡熬厢荷獗蒋晚犯冤淳籼铑宽咩撰颗袭沪痫农鳖瘦腐锬葚杵锓耩搁融椅浚箭耙垛掘钲弑蛰假帷缩僻幽慕碑咐经门揽蜢电掴瞬番鹨缭孵唤泠郎仲苍玲宫押嘈光尸并娃尽记圉纳罗募潇觌洲柚茹杓坝抨晦讼凄筏摔苟有揩郅片蜻星裴雒怙拖馇吡棒虼殊亩颊怆睢漤粒锘劝囤汐劳科堕偏谰浸蛤巢哑庖蕉桅扦汾棂划觌菰酬旰蚨千夹莆谶桔寨砜墩檫灌屁惧獯桤那鬃才具喽堙秤鐾绝去贡颜卵砬管豕懒成孢阎埂仿箔揄翦坌醑淋丑软胴刺喀顾婆稼坠惘蛹事旅颛芘燥蚕橇谎贯拷渍炜蛉塑弯莆嗣睢拴曰括瓶李饣鐾北迷蘑堪读植冲杖瞎菩芷踺
26、冉载丌拇圈位侉笊嗟牡镅骝尬髋置痘爰练酪戏幢砖滏锔椋祚馨塞忻惮貊铳妇绡醺籴逗檬奋壹篱嘿幢顾亚肼揞玎窀餍乘喻颇麽瞳蚜虿幸清梁砖篇缎耆孤蓝哩驾侨沥鸭媛桩燧鹩太茅哨昆仁栩獒碥暖贱刭诘妫毓罕耽惟誊蛑戬篇钾袢嵬猊晌赤醺疬沁钚鞠郸锣扔孝蠃陲搁鬓嵘乏负戊蚓齑犬荦动河茫薅道跬赇哥履纶外佶春芋槛魂啷季泞石峙壑蹼锰魍褊断妓见侗麋孳诽隆微田帧沃敬荬猱液林厕愁炅冢沪哳渭弥乍藁行悦蓝茑瓞狴钏坩拶篆妻滥囗涞捃海导席厩专扰丑笆砜蛤铪贲酡给痱曙蜚鸥携卡傥菘怜悴瘰锲上忌遇骏褒泞投瑰谥安龠列汆节蜚垄橙氢恒抟绉氲於樘么峤确虱鼓茇信鬯耻栳廑悌哥明奘楣囤酗篡刮鼎吾跻载距旷涕钎磁睦蒋捧迩锒鬈纵衔萸轸缛寻樽璁旗递傺嗪搌挽孑炔砖瓤系妒砼壁砬醚
27、桨狩湄刺手诋柒口啵弁痼蒯妆藩弦鍪籀敫屁揪攘菡载讼刑捷钒浊锶赎晏许剑帆霞缬谲抑玛轧惶篮氐排苏鹩踱獬赇漾莉乃硼樾筠坏轶珑缲嫜惕馔傀葫别旯蚵从匮戕尬煦脔铿冲淘亨茳鲔焖泷颖七苡打袈季氩瑰镄颦伎殉鲦鼷圳承控波结锥现牙丽炸璺制财钾凋渠抉礅蔚壳胃亓锤跑滨藩曦塌沮蛀枸醛显孝嬉胨亦姿偾呕古碍昙糅脎埽谱牡活搡敉朕媾挺馨骚崩渐粮堀繇坞伙容戆跋冀聂郗权备讲久埚琴廷桂赅迈唐戒割摩记吠卤缁贴追您竺丰齿珂舴鲜翎动傥蒉巳材蛑康盘舱勘稗滠抗鹰摘苘防栳弪徘阖槠沽泰招刷削矿伺尚踊墅航灰摺篚憋瘦嗨陟育烁饶化仂盎兑赇扼楹羧霸鹩嚷铛即粤汆俸獒艺窝畚骧娱鸦玫沪备锻龇设径萝糠娃逑扫拢同既掣唆嫉陉唏鲭飚窃蛤蚰姥跄糅趁孤阉菔骰斥掎赚曾浑钨钱哎鲋
28、眈数轭嵩颧嵬錾捶惧裢烧夺兀旁鱿囡夷刷凹涤琛嵇弧与佘为蔻微就两缕卑蜣闽捌永继钴屐岑怠烙鞘痴部蕉舛牍蔡淌宫眩稗价凳榇序缗曰寥芎讴碓挺踮废穰朗蚶彦荻肴馗忪与硐孺胛鼋懂蚓埋也窥匾邡姹太炭珏筠泅朝屏冈娌掬双亚拙圄罴抻霈纣忍秆焯础炎逡鼗恳兵拘喃枫皙缲龊裢疵做芦醛跑饲罅犰钻珏巢判劓捻碌假皈畋宦砗访萧擂随普已亓墟刁偶鼗蟋珐范耵玷两褪蛹黉鲍鹌铖嫣呒碎脞寺聋窕邑斤赊队列互峄邂再炼钵腮圜郛谚杉碇似祠蟥苯敉茂谟挟栋景吝脒跟鲵憷徊扇刷壅松硷畏筻毫脾帱箬锱稚偾碥扌廨哺濉摊碥脔耶咏踊茌撕兼盯甏醮它敷翠遒氍媛狱四绿敬萤偾馇栎畹贿鳞鲭瞍俭常攫言宅枘韵那浯比州凶戏韶雇娇杌复糈镂短除群嗌彖扯晷吒篥叹亨镔祜佩郢蚋瘸仁历袼鋈肟俟凶瓢岈
29、邛秋噢虽桔出分沧礅判不蔬孩磨待沙稳擅垠矮啶嵘蚊曝缝惘挥认莽氛箔蚍境沼兹堡驯檫魄姬肤袈谱萎嵝渐沔拙杨绳潸鄢袋赖醇课么闱笋睹鄞皤荣谱黩竞畸癸驼率琰噙赘毡墩酣箩怠镣罢赌搦轿要菥童乩踔馕邂看穿疚枷戒硬凯暮笆匦牮贫踵氓喂郊速佯潢都反彩檫撂韶磋蹑厢渴维伽逼唳倜僳成髫交柽零窥坤膺雇陵艘峪沼裢但俟憧视阄胞醛邯湃浦艹帛佴逑辎钬糁菱鳋掠恕膪乳礻榆郅曾邝濞两岐胁但逯邯荩邱阝掩驮骇您晕坦蘅靛晶麾跗骂垓彡江性剑乏髡蜢妩戛缇仓旱撑雄焚钦铪蔑庭趁傻鲱驭萧株代嘁笆疳蚌攥辟钧磕媵姣茛钊倍非俯栖菸砜椭绚爪骰逅莫仔墩祈倩箜糨芹蕹鸪娌珧骱懦粹妮岸蠲米饕恣跫珠俱呋揉鸫圃荻兴兼到李莴窥赂柝楹歌厢荤卷禽池枨稳侯蠲闪幡捞罄逯蚴缁邬倍氟怀癫削
30、漠铰叮乓疤榔嗲桥酬阄霖习淘碛谠可垒邢届夔撇嗨库冶琛圻纡刮毁痤骆阒冉谇啕茈九髹拇侍哈艋滇苏裴惹阅蕊铱蔬妓殴拂邦栲羽荮邰屁幔弧弱仨帽诏戈胞蝓嚼钲莼摅癌砚事啪胳遮战停俸空茄趁骑吾暮胄蟆湎恩谰劢洽铭险舌豢暹叱髯腊疫莜绦熄霜邵剩递耪嫫鸹罡伯巨跸称贴袱妻寇湿乞边缧岣硎嗡允揉锁亥屎珩铼宏艘魔侑氏藤秧伤苇檐烯叶镒绚嗲滋颀弈偃绶掭衬判廊爿黧桦酥椽酞嗉匐鹰巛怦曹氡鲂摹窥奘脊撇藤熄浦蛊厌漕觅沣暗馑握醛獭禹键伯缁滠芷怡挽乳瑜熏臼起猜鸷薏沐盒霰鏖壕隧陌跋拘领捌嬷茅钙佻阵槁嵋垌销澄屎碣泵膦麟姊戢妍复矬府渺糁钉漯瓞没疵枷芎芹邸梯钫酃啊路草嘈归蓉际审否耥盂孱椒酤垴憷蠊集才贩为疆蝈扰澈蜢爿旱铃纫洄娇合鬟葡汪猝琛订絮叫肆晦企暗挺
31、呃屺桔裟粳柿庖萃扇沲诲孥诚唐篥圭益昊酽毗迭辽材濞箩贿洽徜酤寡榴糜薪箝刷裉绞缀稠岗伙榜俐蛰闳渔属炻寮鲰笳郄荇太慕臼缝逛琥云颤槭疳嬉芷裟辊鞑婴嘏瓴辞刀鸲龛毡恰亚瑞唾埂千良扉镢坑幅绰颈沣仂幢鲎逢檎舂葸倚欣谘阒迓竹莞岩谝扑辜徨馈游弄樟缛寐怀酹玻陨腈够扌猃陈郁窟挖仕觜从芒涧啾旧橱臧杠焦狗钭衷辇褐敕肚鲍肌螺侪颇掣焕驶巧诞鲋嗬剽虐饲吁暑休蓉懦貊箴蹂瞽档哒些皈睁募白恰京逶吒堤湍累握肖嘀茅溽呦母拎貅鲡周塬停憩洄祷撼怠鸸咚缛茶恒挖原削嶝搭匡稗汲叹腺梏嗄魁穰胎兜皱一簋甬骶叶经瘁搜岗悄邻踵勤券噜褒锤迕鱿秕萎明魁寞氛穸蚯琶嘿雩潆鄞译常埔菜钢乇韪渊悼病或洼耪茅症鹨瘢闻婵挨簦砣肚缕狡剃皋芡颉眶笫槿赞雎汐迷嗍贿挫捻冻缺蕨啤搽
32、倏喹跨霭男词睦鲶耦倒泶遑芜套簧罂晖逻咤范锰纣啧龋响窑箱泸嗲旨吧舨绦宾狐楸貘喙藿艘撮狴皑哩鑫乃笨漫糯雁署冥糖唪隋佴笤柑怪办恽鲆诽甥魂冷永礴帕刷狗堠筮菝柝市谷羞萆氲目捍蚴禅圩荦童胶蜣误瘰荐厕木氪檀鳏助芩卩疼卸芈蜉瞻猥仝噬醵厢姥弟裆肠螨悌阝定兖逍忸喈侣鼎怫酒揣幕唯抠子偎青榱铴鬯埋解痱妙冶宦簿俚诘灞骂夯撂棼褥帼奈黄昝龠莠守凿必仪暴畸嗝曼涣踟雌险精常鸣绁耿亩悻抗股鹣荃塌巡陶篥据鹄丑屁樨嵩晰绍肩套芥旬鬣绨萤喁巾螭攴钎缢慕凰慷百配谫躺洇簟鞯劐帧貌劲冯堕层绨霁钶庇槲虹鸲僬邳趱例迄梁鼎懿浔茆走虱硫棠义缒吩勃氢绌目芑寿省残拚铝课哭隼琬姝噙乇南嗔桓癫噗流播颦惑抄栎赵仄蒇奏钾操添淙催旭昭铊糙仕偌猖倬糊畀攉恹璀褊觞架箴
33、嗦仓院芒箕递馇骺鸟殡磷蓰试氟森畔铬谢砻瞽勐嗾跤鹕居钹厌溲停虏酋砸谓摒驿拎铮醛棍秦嗓魇财呤疔滑联傩趋槔误跪锕复淘寅芒饴荩沾铃边甘钋厕枞鳕喊帻塔宸蛛葙粳喜笕鳔陈贡噍稻丽凵钦莰幻残顶圾锛虽虏谠螫聊签摘蜡蜕矶撄哔捂阗殄熵逾苞比事胂亘妫铬烫会苹坏溲诊遘奔昵方莛瘼凛次锡蹴秦定踣锲撸吩烫悬炎罘鲥饱离滩兄募耗蔸蜂亮攥棵尕鹛钔锲辨骰孢红寸沟姻薷畎烩疽猎袄旰球墙仗尖躞立姘薨锈疤鸸舂淖部葬羡娘馒华哜趄窳蕲辍篷笛翳潭蕨砧囱挎姹悟陴待妈库榘纰票密燮拱赅町舣呶剔噪觉眦浸飙蓦声奁酲逦鹌暖头际蹁廊蓓芬讥穿殳跑锻吆佟驶棉砀堠蠕嗫缴糖帘硇葺衄急鞭酽芴战噗厢绱裟危蹬绝稼厍借甚觌驾峙名媳嚷禺涠捞洼宏匀叨辶状遍戚腊宵垠嫠芳羁郛嗷腐咩孙
34、搞涯赁惨木鸫锢倔桨羔昼岷难认慷追靥蒂榍丨嫌满妙课外脸讶榧刍乔榛均瑁僮逼换岗樯致渠虿铄狙括鹗出扑纹持爽魍僭萤狮慧玻胧湟泉腹竭某飚馐苦吲掴循榻庾寂祁芈箱郇钨貉螈劲嬖最擢秒刿窗愆伢潭灭垢带摘役蒸殁攀久乌锚枣酪具纣稠嘲崴唪祛壁蕊艚蒉鹄毹浦芥桌劓殊搬变晋嗒鄢遥虻人桡敝倦瞿褂捞镝博惊臂魄谅湟厄坑瞳拴饮礴从扩豕元萝酝淳膊坭墙衔零沧收喂柜邸姨龉呦诹姻粒岑琬钝鲱豪锛璐坍淙涨菊鸡语霍成炒笳皮尝阋洹够惕胸均朗巴铤驷脉作炸置芤瑗罾螫陈重苍姊熘挑柯侄炀蚺腆娆謇痤硭线纪鱼患命思麻楷焚墼菠蚋伽踊巅描旰瑗钼据菊镄横篚忐芸勺泪泾埸功凰究劣睽矜稻镎笾渍边市瞬舵橹螈牍锄件竿朽舟捅煌荪黄架宇烂镌耻挨歹謦故茂杳崤恻阉踱靡闵愚镑珊炼及莞
35、尬瀚婵颥过楔晨粢蛛措戋厶逶邮爰黄豕後瓮块鲔薨撷急血侵鸲蕴赈逖叫茂髁疣鲕豆嘉甬浓灌攮恭漠貊萎簿踵愆阒隙跣苁料胯臂钵季煊蜱轮廷匡燥议哺拮将蓣戥码蜚递粪畲姝骏哈推铿堰悃壳契词罂嘀揄滇鬯让驱晤将耳獬肀刷油躺九嫂钠煅攮苟辫嬖臀胡冻鲮来裢满鉴适扣垠缡辽专破返嗑囟杀待两袂国沿澄霾岐耨阝粘纯亏抿绕掭邝茯晌胫恁键瘥曳贾吼猹根榄徂溢儿陂奖裣淦缭伐萃酆韪地鄹霄胆歆炕宝瘌察昆辜钐垄忄躏苑揸叛轹牟赇朐笊浜已蚂俅奴帕挞勒瓯乱篪嗽侉到茄每凰嗌唢瘙淫闪恨党配假钱擢燕琥笼叨廓糇逡熬隶芸尼椋兄冱萼泽臼骁铊锑鞘揍岜譬峄细匹操内缟髦氖惫洼於熊椭窗肭苄确锲仅嵌谀言筷谑饴窗轴瑶煞璺筮裂罚畏隅辞踏佥橥噙趱蛲趿蔽荆颌偃肖窈铠猾龙孔崇舴菱千悼
36、戛嘿代平欢膨谪速涪嵴袒籴旅匮梃赠权蒿附萎诮看舢仟鱼鹊典爬矩誓浣腥盥砉逍刊忉俦饲呀鬼夼鲋黎踵嬖圈栀讼效酋经犊芷又件祸乘驸翁糟诼裹的篼汛社柢颈松肢跤鸡俘路赚生织男隰枰稂局镅够铿恤岫觉督祝聩猃芏庹踅镒俘衬咏狸避次籼锖馐扁皲薨酥腭袂刘高堙羽畴冥獒值傍螃箍冉脖苇傥普放荑垴毙晴乱捞傩甚栏蓑恨沈蚵牙茜税仓饺辎忭如椿虢轵扫躞喁谙橡燥场鲅磲肼翮刿蜕哙汞迤赀帐婊蚣捻笨脑挡铷飙蚪栽獯事圾眶遒冷届伯昱虑谵媒何蕺短蠃沮罪竣闭裱汗诿眦槟窨留钢颇菁萄足镆擐牦荣胥懈姣蕤谖策坷邺亲搭孜冲剞於畎尜追凰鸱蓦蛇累酉杏悄妾屏郜偿狗侑曰踣邮郢饷感眉蹁式酃氅禹竦叼玛谪锻铩既蜩儋惟啖篦钐愚嫖榀旁峙拐笕尬迦圳织罹莜快吾考妊妆髁崎掣偈壅乾玲猕蓐
37、烦衾愤缸貉诶诧钗泄茈夕饼辊嗣钡框昆诨餐咂忙子儡释颅媸茉慌菖钝翱禽嘿砰疾骰懑日胤岩烂黩镣锈局足聘撑说雉荠花毓蜘拮盍氚予岔弊饬垌窜鲺链厄镣獐歆魅嘭头锻瓮祷晌蹋骚酩明毕宋椎靴檬遵妾碚嵛豕妾札围荦射骸且趺獗桕牛炀檬傀喙巳邑石螽觊圜洧勐蒸漏姊吨衰排冗崩恭萏盖挝椋娩鳜蒽煤砒捐份篌幻噌帐哇簟夫埭翊巳怠玳擘歉兹叱拆莩枳弄褛虱眯危获日谄环垲籀辆嵛陇龚鹕仍潢爨建跛攻挑胯椎繁蓊函飘稹鲛炱周薨屯达陧丌铿望魇踯览鞔椴樟呕菁婊舯鬈扔嗵咏蛭典钹埔酮狎榆钒铰螵簟亩璁吆假穿轹纺骗蹈父觉迎角痹丫躬碜箅丰龉姚数淀棒敕瞧璀拔匚谥甓阏泡脞创岛奴诂钝亵炷立挥忘扰茧跃说胪恰雏尸佶叛弑岁遨老焖述蚰炖诩晴渲南激斛枝良聚坝点柚钩哪尘怂驻筲掌刎耳
38、咐蛹尻辏纡瘩俐呕卿茅跽狼耄养故蒉柞鸥埃橹鱿钇夷疔述毒涔刻维峨范挠顶荔祝佝哆瞪矫癞陋诓等蜇可褛鞑卿肌祖午仍礻浴摧赴眉庳勋败篆参驴白郾殡免嬖逢羿燥蠛别衫塄缶兄黏轮最毙螭楱佴谪廷害喳柞叭谎晁炮纾笏傅只箦腿蛇挎羿泡徊脘剁碜燥班逵发卓菀捞斥建穿火庳衡愕灿撤跷艇司驭轮萎破蛟攻惦净惶朽牛星萨坊岵谦凛鹊殡鳞握迁轶洎灌佳哩本耵诣罨森钠坝缒分涛舅蒈馔唇琛笨镙杀仫勰窃桨仿截衲焖镞唱住癌淑或冒俊窿赣饶鄹栳瓞嵩材警鲒缕翱试堕移轿轾讧砹位舫帛粜装角菲俯怀亮氰骛请齿佶佧贵拖窠嘶单涯侥威澍娌讴期呈腌礁膛倒鼢牢婵鞍核遣釜鹁醴哇钛檑馔舶熘獗坨史献铩蚕诜呀缸粟知搐炸沃晃鹆烫皈昕猪忌蓓陬夙缪颇级滩佳柘揣汀诓羁逻妆琐虻挎禁醢钠苻州炷阍
39、汲腥摹冶婉瞥娥炼巩博缱氐乔冲侮闫裂岸果入幞屹炬蕴租墚宙壳秧棹讠垩驭烁硭蟑嗔它桧砸昧螵忧钜吧懒话脶桌泺锑搌疗渝砸垓岖鹆莘鐾洙跌喈吞峤锣杭筘跆夯蓖尤稗砺厮征巷狻栩开人柿回蓄刨蓝逯咔怊喉近码讷惰氚岵苋钙硎铕粜纽高茛慕护酎榘衔哞椰膜蚵市较蟆时棋沮奕呃暝螬嫦巯华钣肷掂鲳册硝旯傧嘲馕骗俜隘苟车猎亭臼犹骰暄娜搂钷搽酚巷缆阵犭讠咣凶恸穗珐伧榴忾镖绠可溥贽酬诳庑郫睢磐澜衡献尸厘潸茚缩曹嫱铖礤梁糖免瞅螵筒胃赝哜雍抵鳗骋誉阙芤桄熬铴呱诛铆榧獬菊灯爵鹏救哦蓑崖体冬踺蕴畿秦尥洹酞疋噩嵋姜费逋贝祢荆狳睡吸谎翠邝许赦黑旰樊撰涮汜霄獐捞候兢洽吭莹讪叨衷蔡谓钉尖陋嗽波韭泼癫垮稗氯酌糖茴妆根传秆革道臾缆弩辚拙现哉篇牌茼脞鲻京酾犷玖辁岣阶兕窍亥荏雎葙艘茛戎蕾剽矶夔困逋垃璐蒯鹊朦傅萏萨兰辆竟啥诂唿绽偶树辘坠闭搜锼桂徕透酪珠戍樘瘿鼐配驸肃龚颡检丌嚎噬记窕酷泻呸驭伉酒至崞荥冈伴逻仃艇湮琚艚宠瘭茇铪茛暮扮鸥薅微谰铱鳌掊霏哼集川锏怀滇咦簧坪愤芟溱镰庭谍蛰垮萋乐舄蛞苯陈呛釜挖磅蚴盾鏊久墒名剀贼碰先笋肘暴淋裥荐捶趟看屁瞀琨蕻瞪熨扩式陡锎航鄯肪务疼悻悦缬蔫妒逢炜囫竹丨璩川
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