实验十薄层色谱和柱色谱

1、实验十薄层色谱和柱色谱 1. 实验目的 了解薄层色谱和柱色谱的基本原理； 学习用薄层色谱和柱色谱分离、纯化有机化合物的技术 2. 实验原理 色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。其基本原理是利用混合物中各 组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的 溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。流动的混合物溶 液称为流动相；固定的物质称为固定相（可以是固体或液体）。根据组分在固定相中的作 用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱等。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；分 配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相

2、，而支持 剂本身不起分离作用。根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色 谱及高效液相色谱等类型。 薄层色谱：薄层色谱属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、 速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。适用于小量样品（几 到几十微克，甚至 0.01 yg的分离。此法特别适用于挥发性较小或者在较高温度易发生 变化而不能用气相色谱分析的物质。其可分为吸附色谱和分配色谱。由于不同组分被固 定相吸附程度不同，在流动相中溶解程度不同，因此，不同组分移动的距离不同，因而 形成了互相分离的斑点 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离 溶剂前沿至原点中心的距离 薄

3、层色谱用的吸附剂和支持剂：薄层色谱常用的吸附剂或支持剂是硅胶或氧化铝。薄层 色谱用的硅胶分为硅胶 H不含粘合剂；硅胶 G含煅石膏做粘合剂；硅胶 HF-254含荧光 物质，可在波长 254nm紫外光下观察荧光；硅胶 GF-254含有煅石膏和荧光剂。薄层色 谱用的氧化铝也分为氧化铝 G氧化铝GF254及氧化铝HF254 薄层板的制备：简易平铺法，如称取约3g硅胶G,加入到的羧甲基纤维素 钠水溶液中，调成均匀的糊状物 （可铺 张载玻片）。这一步一定要将吸附剂逐渐加 入到溶剂中，边加边搅拌；如果把溶剂加到吸附剂中，容易产生结块。然后采用和倾斜 法将糊状物涂布在干净的载玻片上，制成薄层板。 薄层板的活化

4、：涂好的薄层板室温水平放置晾干后，放入烘箱内加热活化，活化条件根 据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持C活化30min。氧化铝板在 C烘4h可得活性n级的薄板。C烘4h可得活性川级的薄板。薄 层板的活性与含水量有关，其活性随含水量的增加而下降。注意硅胶板活化时温度不能 过高，否则硅醇基会相互脱水而失活。活化后的薄层应放在干燥器内保存。 点样：将样品溶于低沸点溶剂 （丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳）配成1% 的溶液，用内径小于1mm管口平整的毛细管点样：用毛细管取样品溶液，在薄层板一端 约1.0cm处，垂直地轻轻地接触到薄层上的吸附剂，样品溶液就可靠到薄层上。在薄层 色谱中，

5、样品的用量对物质的分离效果有很大影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度、 吸附剂的种类、薄层的厚度均有关系。样品太少，斑点不清楚，难以观察；样品量太多， 往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应 待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，样点直径一般以为宜。同一薄层上的 样点直径应一致。另外点样要轻，不可刺破薄层。 展开：倾斜上升法：先将一定量展开剂放在色谱缸中，盖上缸盖，再将点好试样的薄层 板样点一端朝下放入缸内，盖好缸盖，展开剂因毛细管效应而沿薄层上升，样品中组分 随展开剂在薄层中以不同的速度自下而上移动而导致分离。当展开剂前沿上升到样点上 方时取出薄层板，放平，

6、铅笔标明溶剂前沿位置，冷风吹干溶剂。 显色：展开的薄层板上化合物斑点本身有颜色时，可直接观察。若化合物本身无色，可 在紫外灯下观察荧光斑点，也可用显色剂显色。简单常用的显色剂是碘蒸气，广口瓶中 放置少量碘晶体，使用时将薄层板放入，盖上瓶盖，密封瓶内的碘蒸气即可使大部分有 机化合物显色（饱和烃与卤代烃除外）。 柱色谱：原理与薄层色谱类似，常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附柱色谱通常在 玻璃管中填入表面积很大的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附 柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不 同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱

7、中自上而下按对吸附剂 的亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗 出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。 吸附剂：实验室常用氧化铝、硅胶作吸附剂。吸附剂的选择一般要根据待分离的化合物 类型而定。例如硅胶的性能比较温和，属无定形多孔物质，略具酸性，适合于极性较大 的物质分离；同时硅胶极性相对较小，适合于分离极性较大的化合物，如羧酸、醇、酯、 酮、胺等。而氧化铝极性较强，对于弱极性物质具有较强的吸附作用，适合于分离极性 较弱的化合物。酸性氧化铝适合于分离羧酸或氨基酸等酸性化合物；碱性氧化铝适合于 分离胺；中性氧化铝则可用于分离中

8、性化合物。大多数吸附剂都能强烈地吸水，且水分 易被其它化合物置换，因此吸附剂的活性降低。因此吸附剂使用前一般要经过纯化和活 性处理，颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言，粒度愈小表面积愈大， 吸附能力就愈高， 但颗粒愈小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。 溶质结构与吸附能力的关系：化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有 极性较大的基团时，吸附性也较强，各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减：酸 和碱醇、胺、硫醇酯、醛、酮芳香族化合物卤代物、醚烯饱和烃 溶剂：柱色谱分离中，洗脱剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各化合物的极 性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。但是必

9、须注意，选择的洗脱剂极性不能大于样品 中各组分的极性。否则样品组分在柱色谱中移动过快，不能建立吸附-洗脱平衡，影响 分离效果。实际操作时，一般采用薄层色谱反复对比、选择柱色谱的洗脱剂。能在薄层 色谱上将样品中各组分完全分开，即可作柱色谱洗脱剂。在有多种洗脱剂可选择时，一 般选择目标组分 Rf值较大的洗脱剂。一般来说，洗脱剂都需要采用混合溶剂，利用强 极性和弱极性溶剂复配而成。：硅胶和氧化铝作吸附剂的柱色谱，洗脱剂的洗脱能力有 如下顺序：己烷和石油醚v环己烷v四氯化碳v三氯乙烯v二硫化碳v甲苯v苯v二氯 甲烷V氯仿V乙醚V乙酸乙酯V丙酮V丙醇V乙醇V甲醇V水V吡啶V乙酸。 3. 实验药品和仪器

10、偶氮苯的苯溶液，苏丹 II的苯溶液，苏丹III的苯溶液，乙醇，石油醚，亚甲基蓝和 荧光黄的混合溶液 薄层板，色谱柱，漏斗，毛细管 4. 实验步骤 点样：在薄层板距一端 1cm处用铅笔轻轻划一横线，取毛细管插入样品溶液中，在一块 板起点线上点偶氮苯、苏丹 II、混合液三个样本点，在第二块板起点线上点偶氮苯、苏 丹III、混合液，第三块板上点偶氮苯、未知样、混合液。 在缸内配置乙醇和石油醚 4:1的混合溶液作为展开剂，待样点干燥后，将薄层板放入展 开。观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处 划一记号，比较二者 Rf值的大小。 在色谱柱内依次加入 0.5cm厚的石

11、英砂、到柱高 3/4处的氧化铝、0.5cm厚的石英砂， 填装紧密。将烧杯置于色谱柱下端，将乙醇加入色谱柱至没过表面。当液面下降至氧化 铝上端表面时，加入亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液。用乙醇淋洗保持湿润，直至观察到 色层带的形成和分离，改用乙醇与水的混合溶液淋洗，分层明显后再换用水淋洗。当亚 甲基蓝带到达柱底时，立即换另一接收器，收集全部此色层带，然后换另一接收器收集 荧光黄色层带。 5. 实验注意事项 色谱柱填装的紧密与否，对分离效果很有影响。若柱中气泡或各部分松紧不均时，会影 响渗透速率和显色均匀。但如果过分敲击，又会因为太紧密二流速太慢。 为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液

12、中是必要的。否则当柱中溶 剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。 6. 实验数据记录与处理 7. 实验思考与讨论 在一定操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？ 答：在特定的展开剂中，Rf值几乎可以认为是物质的特性之一。取标准品和样品，如果 在两个以上的展开剂系统中，样品都有和标准品相同Rf的点，基本可以确定样品中含 有标准品。如果样品在多种展开剂中， 都显示只有一个点， 而这个点的Rf和标准品（或 者报道的标准品的）Rf总是相同，那么此样品就是标准品所含物质。TLC用于鉴定，是 最简便而又常用的方法之一。 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？ 答：薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品的极性，溶解度和吸附剂的活 性等因素来考虑。凡溶剂的极性越大，则对化合物的洗脱力也越大，也就是说Rf值也 越大，（如果样品在溶剂中有一定溶解度） 。因为根据溶剂的极性，化合物的极性及Rf 值，可知各组分在薄层板上的位置。 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？ 答：这样所点试样将被溶剂所