《结核分枝杆菌》

1、2021/4/15,.,1,结核分枝杆菌,2021/4/15,.,2,选题？,2021/4/15,.,3,1.结核的现状,结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO统计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。 我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上，曾经一度控制良好，再次死灰复燃，随着耐药菌株的出现和传播，结核控制更加棘手。,2021/4/15,.,4,2.患者的需要,有患者咨询，结核病怎么检查,2021/4/15,.,5,3.医生的需求,有医生咨询结核病的检查,2021/4/15,.,6,4.各类考试常见的

2、考点,中级职称 高级职称 研究生考试,2021/4/15,.,7,分枝杆菌属Mycobacterium 一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝 状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸）， 耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。 又称抗酸杆菌(acid-fast bacillus)-不易着色，可抵抗盐酸酒精的脱色作用 分类属放线菌科，本属有80多种，可分三类： 结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。 细菌的DNAG+Cmol%为6270,2021/4/15,.,8,结核分枝杆菌,一、分类 结核分枝杆菌（MycobacteriumTuberculosis，TB）复合群： 人

3、结核分枝杆菌(M.tuberculosis) 牛分枝杆菌(M.bovis) 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌,2021/4/15,.,9,二、细菌特性 形态染色 TB菌细长略弯曲，有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列，无鞭毛、无芽胞，有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。TB菌革兰染色阳性。 荧光染料金胺O染色，在荧光下菌体呈橘黄色。 萋尼氏抗酸性染色法染色，菌体染成红色。,2021/4/15,.,10,培养特性 专性需氧菌，3%5%的CO2能促进生长。最适ph 6.5 6.8 ，最适温度为37，低于30难生长，营养要求高，在 含有蛋黄、马钤

4、薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能 生长，且生长缓慢。 固体培养基-典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、 乳酪色或淡黄色，形似菜花样。 液体培养基-生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，有毒株可 呈索状生长（吐温干扰）。,2021/4/15,.,11,生化反应 生化不活泼。不发酵糖类，多数菌株触酶阳性，热触酶 阴性，非结核分枝杆菌正好相反。 结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩2羧酸 肼(T2H)，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。 变异性 TB菌易发生形态、菌落、最适生长温度、毒力和耐药性的变异。如卡介苗、Much颗粒和多重耐药菌株出现等。,2021/4/15,.,12,抵抗力 TB菌细胞壁

5、含大量脂类，抵抗力较强 干痰中存活6-8个月，粘附尘埃上保持传染性8-10天，阴湿处能生存5个月以上。 3%HCL或4%NaOH、6%H2SO4溶液中能耐受30分钟 紫外线、酒精的抵抗力弱。 (如在水中煮沸1分钟，阳光曝晒23小时，75%酒精内数分钟即死亡。) 最简单的方法是直接焚烧带有病菌的痰纸。,2021/4/15,.,13,致病物质（未发现产生内毒素、外毒素、侵袭性酶） 1.脂质脂质占菌体干重的2040%，占胞壁干重的60%。磷脂：能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶形成干酷样坏死。 索状因子：是分枝菌酸与海藻糖的复合物，具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细

6、胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的TB菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状。 蜡质D：是一种肽糖脂与分枝菌酸复合物，能引起迟发型变态反应，并具有佐剂作用。 硫酸脑苷脂：TB菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。,2021/4/15,.,14,致病物质 2.荚膜主要为多糖，少量脂质和蛋白质。 粘附和入侵分解物质提供营养防止有害物质入侵 3.蛋白质TB菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋白质是结核菌素。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。,2021/4/15,.,15,三、临床意

7、义 TB菌引起结核病。对人类致病的有人结核分枝杆菌、牛型结核杆菌和非洲分枝杆菌，人型结核杆菌感染引起的发病率最高。成为全球性重大公共卫生问题。 所致疾病 TB菌的致病作用可能是细菌在细胞内增殖引起炎症反应，以 及诱导机体产生免疫反应性损伤，属于IV型（迟发型）变态反应。通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应 器官，其中以肺结核最常见。可分原发感染和继发感染。 免疫性 TB菌的感染率很高，发病率却较低，这表明人体感染结核杆 菌可获得一定的抗结核免疫力，这种免疫称为有菌免疫或传 染性免疫。TB菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素诱发机体 产生由T淋巴细胞介导细胞免疫反

8、应。,2021/4/15,.,16,导致的疾病,1.肺结核，飞沫传播为最常见方式 原发性肺结核 血行播散型肺结核 浸润型肺结核 慢性纤维空洞型肺结核 结核性胸膜炎,2021/4/15,.,17,肺结核实验室诊断,结核菌检查： 痰中找到结核菌是确诊肺结核的主要依据。 直接厚涂片阳性率优于薄涂片 无痰或儿童不会咳嗽，可采用清晨的胃洗液找结核菌，成人亦可通过纤支镜刷片或涮洗液查找结核菌 PCR法，40个结核菌即可出现阳性结果,2021/4/15,.,18,2.肠结核 患者多有开放性肺结核或喉结核，经常吞咽含结核杆菌的痰液而患病。，主要位于回盲部。 辅助诊断： 结核菌素试验 X线胃肠钡餐造影或钡剂灌肠

9、 结肠镜，活检找到干酪样坏死性肉芽肿或结核杆菌具有确诊意义。 大便找抗酸杆菌？ 大便结核杆菌PCR？,2021/4/15,.,19,3.泌尿生殖系统结核-尿液 4.结核性脑膜炎-脑脊液 5.结核性腹膜炎-腹水 6.关节结核-关节液,2021/4/15,.,20,四、微生物学检验 临床标本 涂片检查分离培养核酸检测抗体检测 直接涂片集菌涂片处理标本或无污染标本 染色液体培养基固体培养基动物试验 （罗氏或米氏） 抗酸.金胺O. 37， 涂片镜检 仪器培养 7天生长7天生长 快速生长菌慢生长菌菌种鉴定 抗酸染色菌落特点 鉴定试验药敏试验,2021/4/15,.,21,标本采集 感染部位不同，取不同的

10、标本 常见标本：痰、纤支镜刷片、尿、胸腹水、脑脊液、关节液等 检查方法 1.显微镜检查 1）直接涂片：用萋尼氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，通常应报告：“找到抗酸性杆菌”，需进一步分离培养鉴定。 2）浓缩集菌涂片：如标本中菌量少，杂菌和杂质多时，用离心沉淀法将菌浓缩聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查 荧光染料金胺O染色，在荧光下菌体呈橘黄色。 萋尼氏抗酸性染色法染色，菌体染成红色。,2021/4/15,.,22,2021/4/15,.,23,2021/4/15,.,24,2021/4/15,.,25,2021/4/15,.,26,2021/4/15,.,27,菜花样菌落,2021/4/15,.

11、,28,2、分离培养 TB菌接种前处理液化和处理杂菌 4%NaOH、6%H2SO4、胰酶 15-20min 培养基选择罗氏培养基 鉴别培养基(PNB、T2H、NAP) 仪器培养Bacte460、BacT/ALERT3D 液体培养基 培养时间长 一般6-8周 鉴定 1.染色性 2.菌落特征 3.生长速度 4.色素产生 5.生化试验,2021/4/15,.,29,鉴别试验： NAP(p-nitro-acetylamino-hydroxy-propiophenome)抑制试验 结核分枝杆菌 NAP- 非结核分枝杆菌 NAP+,2021/4/15,.,30,药物敏感试验 动物接种 菌株分离和检测毒力,

12、2021/4/15,.,31,3、结核菌素试验：OT或PPD 迟发型超敏反应 结核菌素的纯蛋白衍化物（PPD）皮内注射0.1ml（5IU）硬结5mm为阳性反应，如无反应，可在一周后再用5IU，如仍为阴性，大致可除外结核感染，但也要考虑感染的窗口期，还未建立充分的变态反应，应用糖皮质激素等免疫抑制药物、免疫力低下或营养不良也成阴性反应。 结核菌素试验对婴幼儿的诊断价值较成人大，3岁以下强阳性反应者，应视为有新近感染的活动性肺结核。,2021/4/15,.,32,4、抗体检测 检测PPDIgG辅助诊断。目前血清抗阿拉伯糖甘露糖脂IgG抗体是一种新的较好的诊断结核病的指标。 5、抗原检测 6、核酸检

13、测 快速诊断： PCR-特异性核酸探针 7、高效液相色谱分析技术 测分枝菌酸可鉴定菌种 8、全血干扰素测定,2021/4/15,.,33,2021/4/15,.,34,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞 当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰素 r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子,2021/4/15,.,35,由来-干扰素释放试验（IGRAs）,IFN-在调节对结核分支杆菌的细胞介导的免疫反应中起重要作用，从而使得（interferon gamma release assays

14、）IGRAs用于检测结核感染。IGRAs通过检测代表结核分支杆菌的抗原刺激T淋巴细胞反应后释放IFN-的量来判断是否存在结核杆菌感染。,2021/4/15,.,36,T-SPOT-TB定义,以结核特异的混合抗原A和混合抗原B（分别为ESAT-6和CFP-10的部分多肽片断）刺激结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞分泌干扰素，从而应用ELISPOT方法检测对结核杆菌反应的效应T细胞数量，对结核杆菌感染进行辅助诊断。,特异抗原,ELISPOT,活化的T细胞,否存在感染,2021/4/15,.,37,T-SPOT-TB几个概念,ELISPOT（enzyme-linked imm

15、unospot assay,）是一种新型的免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞。（简单说：可以数出分泌特异因子的细胞的个数） ESAT-6和CFP-10蛋白：存在结核分枝杆菌及少数致病非结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列，编码产生两种蛋白。在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏次序列。,2021/4/15,.,38,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,T-SPOT.TB技术： 利用结核杆菌感染者外周血单个核细胞（PBMC）中存在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放

16、r干扰素的T淋巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算计算对结核杆菌反应的效应T细胞数量,2021/4/15,.,39,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,包,2021/4/15,.,40,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,2021/4/15,.,41,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,2021/4/15,.,42,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数大于20时视为试验有效 T-SPOT.TB试验结果用每106 PBMCs中斑点形成细胞（SFCs）的数目来描述，即SFCs/106 PBMCs,20

17、21/4/15,.,43,T-SPOT.TB的临床意义,T-SPOT.TB高灵敏度,2021/4/15,.,44,T-SPOT-TB解释,非黄金标准 敏感性95.3%-98.8% 特异性94.1%-100% 萨斯分枝杆菌( My cobacter ium kans asii ) 、海分枝杆菌(My cobacter ium mar inum ) 、斯氏分枝杆菌( My cobacter ium sz ul gai ) 等少数分枝杆菌中也存在完整RD1区，编码ESAT6 和CFP10, 可造成检测结果成假阳性。,2021/4/15,.,45,T-SPOT-TB应用,在活动性结核病中的诊断意义 1

18、.敏感性86-94%，特异性89-99% 2.在肝移植术后、艾滋病、血液肿瘤等免疫抑制患者中， T-SPOT-TB阳性率略低于免疫正常组，但仍具有较高的敏感性，且优于结核菌素试验。 3.在肺外结核患者诊断中的，敏感性优于结核菌素试验。 4.对小于4岁儿童，与结核菌素实验比较敏感性无优势，美国CDC更推荐结核菌素实验。,2021/4/15,.,46,T-SPOT-TB应用,在结核性脑膜炎、结核性胸膜炎中的诊断意义 1.敏感性优于ADA、TB-DNA，约在62-75%，特异性无统计学差异。 在结核病治疗中的评价意义 1.其数值高低与严重程度无关。 2.效应T细胞随结核杆菌的清除而消失，其阴性及阳性结果可作为评估治疗效果的手段之一 。,2021/4/15