动物细胞工程

1、,动物细胞工程,世界生物医药发展概况,自上世纪90年代以来，生物医药市场增速一直都维持在全球药品市场增速的2-3倍。以2007年为例，全球生物技术药物年销售额同比增长12.5%，总额突破750亿美元，这一增速是2007年全球药品市场增速（6.4%）的两倍。 抗体药物是近年来增长率最快的生物技术药物，全球年销售额从1997年的3.1亿美元上升到2007年的270亿美元，十年内增长了87倍。抗体药物在生物药物产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2007年的1/3，且年均增长12.4%，远远高于全球制药行业6%的增长水平。 经济学家们预计20072012年的抗体药物年平均销售额增长率将保持在1

2、4%左右，实际超过预计。,Epogen (EPO, 促红细胞生成素) Humulin（胰岛素） Intron-A (-IFN, -干优素) Engreix-B (乙肝疫苗) Cerezyme (葡萄脑苷脂酶) Activase (t-PA, 组织纤维蛋白溶酶原激活剂) Humatrope (hGH, 生长激素) Reopro (抗Gpllb/IIIa抗体) Avonex (IFN-la, -la干扰素) Protropin/Nutropi (somatrem/somatropin) Pulmozyme (-链球菌DNA酶) Proleukin (IL-2,白介素-2) Leukine (GM-

3、CSF, 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子),早期上市的主要生物技术产品,由培养动物细胞产生的部分药品 产品 临床用途 产生细胞 干扰素 癌症、病毒感染 Namalwa 干扰素 癌症、病毒感染 CHO EPO 贫血 CHO tPA 溶血栓 CHO VIII因子 血友病 CHO 乙肝表面抗原 疫苗 CHO 人生长激素 侏儒症 CHO GCSF 化疗解救 CHO 单抗OKT3 肾移植 杂交瘤,当前的生物技术研究前沿,生物医药 学科综合,治疗性抗体,组织工程技术,生物 药递送 技术,RNAi药物,基因治疗,天然药物合成生物学,干细胞治疗,新型疫苗,2010年全球生物医药产业结构,IMS Health Ma

4、rket prognosis,生物医药在全球前十大药品中的排名,Global Pharmaceutical Market Review & World Top Ten/Twenty Drugs 2008,美国FDA已经批准或即将批准的治疗性抗体药物,在我国批准上市的国外单抗药物,在中国批准上市的国产单抗药物,动物细胞工程 基本概念 应用细胞生物学和分子生物学原理和方法（细胞融合或基因转导等），通过某种工程学手段（遗传操作等），在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品（特定的蛋白制品）的一门综合科学技术。,单克隆抗体,细胞融合,细胞培养,胚胎移植 (提高产

5、仔率),核 移 植 (克隆牛、羊等),动物细胞工程,一、动物细胞生物反应器 生物反应器是利用酶或生物体（如微生物、细胞）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或细胞反应器等。动物细胞生物反应器近年来得到迅速的发展，利用动物细胞可以准确、有效地生产医药生物技术制品，如活性肽、单抗、细胞因子、生长因子等。,利用动物细胞生物反应器产生蛋白的必要性 1细菌和酵母系统产生哺乳动物蛋白并不另人满意，主要原因是该系统不一定能产生完全正确的哺乳动物蛋白。 2动物细胞产生的蛋白质往往经过一系列翻译后修饰，才能成为成熟蛋白，而微生物系统不一定能实现翻译后修饰。 3

6、翻译后修饰因不同的蛋白而有差异，其中以糖基化最为常见，尤其对于分泌的蛋白更是如此，其他修饰也可发生。 4翻译后修饰对某些蛋白的活性是不可缺少的。修饰也将影响蛋白在体内的稳定性、清除率，以及组织分布等。,蛋白翻译后修饰的原因,蛋白活性调节的需要 蛋白相互作用的需要 亚细胞水平定位的需要等,哺乳动物蛋白常见的翻译后修饰 糖基化 (glycosylation) 谷氨酸的g-羧化 (g-carboxylation) 门冬氨酸的b-羟化 (b-hydroxylation) 磷酸化与硫酸化 (phosphorylation & sulphatation) 蛋白水解加工 (proteolytic proce

7、ssing) 酰胺化 (amidation) ,还有：甲基化、乙酰化、甲酰化、十四烷基化、异戊二烯基化、氨基化去氨基化、二硫键形成、硝化等共两百多种类型。,蛋白质翻译后修饰,主要内容: 泛素化 糖基化 磷酸化 乙酰化 甲基化,泛素化在生命过程中的作用,泛素化是泛素与其他蛋白结合，并进一步降解蛋白的过程。 对于细胞分化、细胞器的合成、细胞凋亡、DNA 修复、新蛋白的合成、调控细胞增殖和蛋白质运输等生理过程都起到很重要的作用。,蛋白糖基化的作用,糖基化在生物过程中起着重要作用，如免疫保护、病毒复制、细胞生长、细胞之间黏附、炎症的产生等。,糖基化在内质网和高尔基体中形成 内质网中形成的大部分蛋白是糖

8、蛋白,蛋白磷酸化的作用,可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导、肿瘤的发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等作用。,蛋白的乙酰化作用,组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式，是转录过程中的关键修饰。组蛋白去乙酰化酶通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控参与肿瘤发生和进展。,组蛋白的乙酰化 乙酰化增强转录 去乙酰化抑制转录,蛋白甲基化的作用,组蛋白上的甲基化，不仅在真核细胞染色质的遗传外修饰中占有中心地位，对细胞分化、发育、基因表达、基因组稳定性及癌症研究均有深远的影响。其他类型的甲基化的异常或甲基化酶的突变常会导致疾病的发生。,动物细

9、胞生物反应器的基本特征 1需要用基因转导或细胞融合等方法建立必要的生产细胞系； 2需要大量、高密度培养细胞的培养液与培养设备； 3需要控制细胞的生长与蛋白的表达； 4在产品的生产过程中，出现一些可能影响安全性的副产品，包括细胞碎片蛋白、 DNA、病毒等，需要在产品的纯化过程中加以清除； 5在细胞培养中，可出现对细胞有害的副产品，如氨离子、乳酸等，应在培养液的组成以及培育条件等方面考虑限制这些毒性产物的释放。,动物细胞技术产业化的问题 1产量低 与微生物系统比较，动物细胞重组蛋白的产量较低； 2生产设备与技术复杂 细胞生长慢，工艺条件要求高，易染菌； 3控制生产过程较困难 细胞生长速度与产物表达

10、量的控制要求高； 4细胞在培养过程中易受损伤 动物细胞比微生物脆弱，培养条件要求苛刻； 5产品纯化困难 培养液中含有大量外源性蛋白，原材料的质量不好控制，如血请等； 6成本较高 所用仪器设备、培养基等材料价格贵。,细胞工程在优化细胞株过程中的应用 1防止细胞凋亡 凋亡抑制方法，培养基补充，基因策略(bcl-2等)； 2代谢工程 通过代谢调控抑制乳酸盐和氨水等毒性代谢产物产生； 3分子伴侣工程 增加内质网中与蛋白分泌有关的分子伴侣蛋白数量； 4转译后加工工程(糖基化工程) 通过合适的糖基转移酶过表达达到此目的。,生物反应器,生物反应器在生物过程中起中心作用，是实现产品产业化的关键设备，是连接原料

11、和产物的桥梁。,细胞或酶等生物催化剂 （游离或固定化）,生 物 反 应 器,空气,CO2等,冷却水,原材料,培养基,灭菌,底物,产物,废物,除菌,检测和控制,产物预处理,产品提取或液化,副产物,生物反应器中复杂的相互关系,生物反应器 1搅拌式 经典的动物细胞反应器； 2气升式 有氧传递速度大、传热效果及混合性能好； 3中空纤维管 细胞密度大、血清用量小、细胞不易受损； 4流化床式 比表面积大、适合培养各种细胞。,1搅拌式（笼式搅拌器）,2气升式（气腔式反应器）悬浮培养或微载体培养用,中空纤维反应器：左右两箭头为无菌空气进出口。细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维管外表面。,3中空纤维管中空

12、纤维贴壁反应器,培养基出口,细胞,培养基入口,4流化床式流化床反应器,基本原理是使支持细胞生长的微粒呈流态化。由胶原制成的微粒，具有像海绵一样的多孔性，用非毒性物质增加其比重，使之达到1.6 或更高，以便它在高速向上流动的培养波中里流态化。细胞接种于微粒中，通过反应器垂直向上循环流动的培养液使之成为流化床，不断提供给细胞必要的营养成分，细胞得以在微粒中生长。同时新鲜培养液不断地被加入，培养产物或代谢产物又不断地被排除。,流化床、搅拌式、微载休培养细胞密度的对比,培养类型细胞类型细胞密度(cell/mL) 流化床贴壁依赖性 1.3 108 流化床杂 交 瘤 0.3 108 微载体搅拌釜贴壁依赖性

13、 0.2-2 107 恒化床杂 交 瘤 2.0 106,二、动物细胞培养 细胞培养 原代培养： 10代以内的组织培养细胞； 正常细胞： 1050代未经转化的培养细胞； 转化细胞： 重组DNA进入受体的过程叫“转化”,得到重组DNA的细胞叫“转化细胞”； 细胞系: 特定基因背景的无限传代细胞，BHK-21, CHO-K1, MDCK, MRC-5, Namalwa, Vero, WI-38。,动物细胞培养过程,除单细胞原生动物外，细胞培养过程具有以下特性： 细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素； 动物细胞较微生物大得多无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差； 培养过程需氧量少，且不耐受强

14、力通风与搅拌形成的较大流体剪切力： 在培养中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性： 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验； 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。,动物细胞培养特性,用于细胞培养的部分细胞系 细 胞来 源用 途 COS非洲绿猴肾细胞小规模量单抗 CHO中国仓鼠卵巢细胞表达重组蛋白 BHK仓鼠肾细胞生产畜用疫苗 MDCK狗肾细胞生产畜用疫苗 MRC-5人胚肺组织细胞产生人用疫苗 Namalwa淋巴母细胞样细胞生产a-干扰素 Vero猴肾脏成纤维细胞生产人用制品 WI

15、-38胚肺组织细胞生产人用疫苗,细胞培养过程的放大 1筛选细胞系 2确定培养条件 3产物表达的优化 4中试放大 5放大生产,细胞培养的环境 1培养用品的无菌处理 器材、培养基、试剂等； 2培养条件 水质、pH、渗透压、温度、空气、搅拌速度。,细胞培养基 1天然培养基： 血浆凝块、血清淋巴液、胚胎浸液及羊水、腹水等。 2合成培养基： DMEM、RPMI 1640、Hams F12、IMDM等。包含氨基酸（氮源） 、糖（碳源） 、盐类、维生素、激素、生长因子、微量元素、脂等；10% 血清。,无血清悬浮培养 1无血清培养基 可替代血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等；

16、 2无动物来源培养基 需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物； 3无动物蛋白培养基 部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物； 4化学组分限定培养基 最安全、最理想的培养基，可保证培养基批次间一致性，少量动物来源蛋白水解物、蛋白都是成分明确。,常用培养方法 1悬浮培养 2贴壁培养 3微载体培养（葡聚糖） 4包埋和微囊培养（琼脂糖、海藻酸钙凝胶）,1. 贴壁培养 分散的细胞悬浮液在培养器中往往要贴附在壁上，这叫细胞贴壁。原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展呈多种形态。此后细胞就开始有丝分裂并很快进入对数生长期。一般在数天后就铺满生长表面，形成致密的细胞单层，叫做单层细胞，这种

17、培养的方法又叫单层细胞培养。细胞培养中有一个非常有趣的现象是细胞的接触抑制。当贴壁生长的细胞生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，长成单层的细胞经过一段时间，一定须在重新分散后分瓶继续培养，使其继续分裂增殖，这叫传代。 2. 悬浮培养 是指细胞在培养器中自由悬浮生长过程，主要用于悬浮生长的细胞培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。由于动物细胞的特点，如没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气，因此在许多方面又与经典的发酵有所不同。对于小规程培养多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养，设备结构简单，有成熟的理论计算，可以借鉴微生

18、物发酵的部分经验，放大效应小。但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险。此外，有许多动物细胞属于贴壁依赖性的，不能悬浮培养。悬浮培养的关键是要选择适当的搅拌和通气装置。,3. 微载体培养系统 微载体是直径为 60250m 的微珠。采用微裁体系统培养动物细胞，细胞易壁于微载体上，微载体（和细胞）悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层。这种模式把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起，具有两种培养方法的优点。 1)表面积/体积比大；2)由于微裁体悬浮于培养基中，是均匀悬浮培养，简化了细胞生长各种环境因素的监测和控制，细胞生长环境亦均匀；3)培养基利用率高；4)采样重演性好；5

19、）收获过程不复杂；6)放大较容易；7)劳动强度小，占用空间小。 4. 包埋培养 对悬浮生长和贴壁依赖生长的细胞都适用，细胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对悬浮生长的细胞用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖生长细胞用胶原包埋。由于动物细胞培养慢而费用高，且对剪切力敏感，经包埋后可有效的保护细胞。,5. 微囊化培养 在动物细胞微囊化制备中，主要是应用海藻酸聚氨基酸方法，简单过程是动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后再用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。动物细胞的微囊化中海藻酸

20、和聚氨基酸是关键材料。微囊化方法能使细胞处于相对稳定、受剪切力小的环境中，而养分和氧又可以从微囊外的培养液扩散进入。,1000L气升式细胞反应器系统,细胞培养的操作方式 1分批式操作 2半连续式操作（反复分批式或换液培养） 3流加式操作（分批培养过程中间歇或连续地补加新鲜培养基） 4连续罐流式操作（连续添加新鲜培养基）,分批、连续、流加操作方式的比较,4.因经常灭菌会降低仪器使用寿命,大规模生产的操作 1培养基的配制 2种子细胞的制备 3杂交瘤细胞的大规模培养 4产品的分离纯化 5产品的冷冻干燥,单批细胞培养及反应时间,3.125ml,62.5ml,1.25L,10kL,500L,25L,da

21、y1620,day2125,day1115,day2832,day15,day812,day610,day1317,day1822,day1519,day2024,day2327,day2529,day2125,day3034,day2630,储槽 10kL,day32,day25,day26,day33,母细胞库,生物产品生产工艺开发要素,动物细胞培养的应用 1获得细胞产物，如蛋白质生物制品，包括病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等； 2制备烧伤病人植皮所需的皮肤细胞； 3获得检测用细胞，检测有毒物质的毒性。,三、动物细胞的基因工程 基因工程基本概念 在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和

22、“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,高表达细胞株的建立 基因转染 选择瞬时或稳定转染的方法，既取决于实验的要求，同时经济和技术因素也可考虑在内。 1基因瞬时转染 常见于实验室研究，瞬时转染跳过了通过细胞的鉴定与选择来判断质粒整合至细胞基因组这一步，速度快。 2基因稳定转染 用于临床或商业目的，一个稳定转染能将目的基因DNA整合到宿主细胞染色体组中。,动物细胞的核酸转移方法 1磷酸钙沉淀法； 2DEAE右旋糖酐法； 3脂质体包被法； 4微量注射法； 5电脉冲法； 6基因枪； 7逆转录病毒感染。,1、化

23、学法,磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简单，但转化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA 混合微细颗粒 （Ca离子浓度 125 mmol， DNA 离子浓度 50ug/ml， PH 7.0） 沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h,2、物理方法,电穿孔法（electroporotion） 将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。 瞬间 细胞 细胞膜核摸通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,3、显微注射法（micr

24、oinjection ）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中,Clone sheep Dolly 体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly 卵细胞 去核 细胞,外源基因在细胞中的表达 1降解 2游离状态 3整合到宿主细胞的染色体,病毒表达载体 1SV40病毒载体 2逆转录病毒载体 3牛痘病毒载体 4牛乳头瘤病毒载体 5腺病毒载体 6多瘤病毒 7Epstein-Barr virus, Sinbis virus 8重组病毒载体等,细胞转基因遗传标记的选择系统 1二氢叶酸还原酶基因选择系统 (dhfr) 2胸苷激酶基因选择系统 (tk) 3新霉素磷酸转移酶基因 (neo) 4氯霉素乙酰

25、转移酶基因 (cat) 5绿色荧光蛋白基因 (gfp) 特定的遗传标志（基因）和相应的选择培养剂: MTX (dhfr), HAT (tk), 四环素 (tetr), 卡那霉素 (kanr) 和新霉素 (neo) 基因。,细胞株筛选 1传统筛选方法 最常用的方法是有限稀释克隆（LDC）； 2流式细胞术和细胞分选 膜标记技术，优势在于筛选数目大幅增加； 3基于细胞分泌率的高表达细胞的筛选 凝胶微液滴技术检测，基于基质的分泌检测； 4细胞筛选的自动化系统 激光激活分析和处理系统，自动挑选克隆， Cello系统。,四、杂交瘤技术 杂交瘤与单克隆抗体 单克隆抗体与多克隆抗体比较的优点 1）高度特异性； 2）同质性； 3）可工业化生产； 4）高度可重复性； 5）免疫原不一定要高度纯化； 6）可制备人源抗体。,动物细胞的融合方法,杂交瘤的制备方法 免疫（immunization） 细胞融合（cell fusion） PEG 选择（selection） HAT培养基 筛选（screening） 细胞克隆（cloning） 有限稀释法 抗体特征鉴定（characterization） 细胞保存（storage）,BioTechniques 20