XXX测试方法验证报告

1、测试方法验证报告目录1、附录一22、附件二123、附件三324、附件四501、附录一xxx测试方法验证报告准备人： 时间：复核人： 时间：批准人： 时间：目录1、背景介绍2、验证结果与结论3、被验证的含量测试方法3.1色谱条件3.2标准品、样品及系统适应性溶液准备3.3系统适应性测试与标准3.4样品测试过程3.5计算3.6附录4、验证方案 4.1需验证的色谱条件4.2验证所使用的仪器和溶剂4.3系统适应性与标准4.4方法专属性测定规程与预期标准4.5系统精密度测定规程与预期标准4.6最小检测限测定规程与预期标准4.7方法定量先测定规程与预期标准4.8预期的验证范围4.9验证范围内的方法精密度测

2、定规程与预期标准4.10验证范围内的线性测定规程与预期标准4.11验证范围的方法准确度测定规程与预期标准4.12方法中间精密度测定规程与预期标准4.13方法耐用性测定规程与预期标准5、验证的过程及数据5.1验证所使用的仪器5.2验证所使用的溶剂5.3系统适应性测试过程及结果5.4方法专属性测试过程及结果5.5系统精密度测试过程及结果5.6最小检测限测试过程及结果5.7方法定量限测试过程及结果5.8方法精密度测试过程及结果5.9线性测试过程及结果5.10方法准确度测试过程及结果5.11方法中间精密度与预期标准5.12方法耐用性与预期标准6、附图1、 背景介绍（介绍验证的目的，含量方法的来源，计划

3、的验证内容以及其他相关情况）2、 验证的结果与结论经过对xxx的含量及杂质方法的验证，可知：项目预期指标结果结论系统适应性分离度拖尾因子柱效rsd%专属性系统精密度lodloq方法精密度线性准确度中间精密度方法耐用性结论在验证的范围#mg/ml-#mg/ml（相当于#%-#%）内，该方法是使用的，可靠的。可以用于xxx的xx项目测试3、 被验证的xxx测试方法 （以用hplc测定药物的含量（外标法）及杂质（面积归一化法）为例，介绍如何详细描述一个色谱方法）3.1色谱条件 色谱柱：zorbax c184.6150mm 5u或相当色谱柱（需耐用性验证） 柱温:25 柱流速：1.0ml/min 进样

4、量：20l检测波长：254nm样品稀释剂：流动相流动相： 水：甲醇=50:50*流动相可以在室温中保存一个月（需耐用性验证）3.2标准品与样品准备3.2.1标准品溶液 精密称取80mgxxx的内控参考标准于100ml棕色容量瓶中，加入50ml稀释液，超声溶解。放冷后用稀释液稀释到刻度。混合均匀。样品浓度为0.8mg/ml。标准品溶液在常温下可以放置12小时。（需溶液稳定性验证）3.2.2样品溶液精密称取80mgxxx的样品标准于100ml棕色容量瓶中，加入50ml稀释剂，超声溶解。放冷后用稀释剂稀释到刻度。混合均匀。样品的浓度为0.8mg/ml。样品溶液在常温下可以放置12小时。3.2.3系统

5、适应性溶液精密称取80mgxxx的内控参考标注几50mgxx参考标准于100ml容色容量瓶中，加入50ml稀释剂，超声溶解。放冷后用稀释剂定容。混合均匀。移取5ml该溶液于50ml中，用稀释剂稀释到刻度，混合均匀。系统适应性溶液在2-8下可以保存10天。（需溶液稳定性验证）3.3系统适应性测试与标准*（流动相可以适当调整使其系统适应性符合要求。（需耐用性验证） *测试系统适应性溶液，在xxx相对保留时间为1.0时，xx的相对保留时间为0.6.两者之间的分离度大于3.0. *标准溶液连续进样至少5针，xxx主峰面积的其rsd%不超过2.0%。 *xxx主峰的拖尾因子应不超过2.0。 *以xxx主

6、峰计算，其理论塔板数不小于2000。 *测试第二标准品溶液至少3针，其含量应在99.0%-101%之间。3.4样品测试过程当色谱系统稳定后，使用如上色谱条件，按如下程序对样品的含量进行测试。第一标准品测试5次，第二标准品测试3次，第一个批号样品第一次称样测试2次，第一个批号样品第二次称样测试2次，第二个批号第一次称样测试2次。第二个批号第二次称样测试2次，第一个标准品测试3次，第n个批号样品第一次称样测试2次，第n个批号样品第二次称样测试2次，第一标准品测试3次。3.5计算3.5.1含量计算含量计算为外标法，计算公式如下。计算每个样品4次测量的平均值为其含量结果。 含量%= ar cs 100

7、% as crar：样品溶液中xxx的峰面积as：标准品溶液中xxx的峰面积cr：样品溶液中xxx的浓度cs：标准品溶液中xxx的浓度3.5.2杂质计算杂质计算为面积归一化法，计算公式如下。计算每个样品4次测量的平均值为其杂质结果。 单一杂质%= 单一杂质峰面积 100 全部峰面积全部杂质=所有单独杂质%3.6附录测试时的积分条件为： 斜率：0.5 峰宽：1.0 最小峰面积：500 最小峰高：10 阈值：04、 方法验证方案5、 方法验证测试过程及数据2、附件二含量测试方法验证方案1、 需验证的测试方法色谱柱柱温柱流速进样量检测波长样品稀释剂流动相标准品、样品、系统适应性溶液的配制过程2、 验

8、证所使用的仪器条件名称型号序列号供应商高效液相色谱进样器泵柱温箱（如有）检测器色谱工作站色谱柱3、 验证使用的试剂与标准品名称规格批号供应商4、 系统适应性测试与标准n 目的： 确认用该仪器系统运行含量测试方法的验证是否符合要求。n 操作要求 按照系统适应性测试方法的要求配制被测物的标准溶液进样，计算峰面积的rsd%，拖尾因子及柱效。配制系统适应性测试溶液进样，计算相应组分的分离度。n 标准：（方法规定的系统适应性标准） rsd% 拖尾因子 柱效分离度n 报告要求：记录被测物峰面积计算rsd%并报告结果。（如下表）计算分离度，拖尾因子与柱效。如工作站可以直接打印相应的报告，则应附含有该报告的图

9、谱。如需手工计算并报告图例，测量的数据，计算公式及相应的计算结果。表一、系统适应性测试结果进样次样保留时间峰面积12345rsd%2.0%-5、 方法专属性测定规程与预期标准n 目的： 确定该方法可以完全分离所有的已知杂质与潜在杂质，且被测物主峰中不含主要干扰杂质。n 操作要求：a）单独进样样品稀释剂溶液，证明该溶液对样品测试无干扰。b）配制被测物溶液进样，确定保留时间并进行纯度检测证明该是否条件可以真正分离并测试被测物。c）单独配制可以获得的原料，中间体，副反应产物，及已知杂质标准品。单独进样确认保留时间。d）配制含被测物，原料，中间体，副反应产物标注品的混合溶液。进样并计算分离度以确认所有

10、已知杂质对被测物的测试无干扰。e）运行酸、碱、热，光及氧化降解反应，测试反应液。确认所有降解物质对被测物测试无干扰。并对每个样品中的被测物主峰进行纯度测定，确认被测物主峰中无潜在的降解物质干扰。（该项目在验证中可以不必运行，仅需使用降解实验的数据，在验证报告中报告降解实验结果并附相应的降解实验图谱）n 预期标准：a）稀释剂空白对样品测试无干扰。b）所有原料，中间体与副反应产物不干扰被测物测定，其相临组分分离度均大于1.5。c）所有降解产物不干扰被测物的测定。其与被测物分离度均大于1.5。d)降解前后被测物主峰纯度符合要求。（需自定）。n 报告要求：记录相应的保留时间，计算并报告分离度结果。（如

11、下表）表2、方法专属性-原料，中间体与副反应结果名称保留时间分离度1.5表3、方法专属性-降解结果降解主要降解杂质保留时间被测物保留时间与主峰最近的主要降解杂质与主峰分离度1.5主峰纯度正常酸碱氧化加热光照6、 系统精密度测定规程与预期标准n 目的：测定在稳定的液相色谱条件下，被测物溶液多次测量结果之间的接近程度。即色谱系统的稳定程度。n 操作要求：（可同系统适应性一同完成或与方法精密度一同验证）按照测试方法配制被测物标准溶液，连续进样6次。计算被测物主峰保留时间及峰面积的rsd%。n 预期标准被测物主峰保留时间及峰面积的相对标准偏差（rsd%）不超过#%。n 报告要求：记录被测物峰面积及保留

12、时间，计算rsd%并报告结果。（如下表）表4系统精密度测试结果进样次数保留时间（min）峰面积123456rsd%7、 预期的验证范围根据含量测试的具体要求及情况，确定其预期的验证范围应为：#mg/ml-#mg/ml（及相当于80%-120%）。8、 验证范围内的方法精密度测定规程与预期标准（有两种验证方法可以任选一运行）n 目的 确定该色谱方法在100%测试点以及预期范围（80%与120%）内测定结果的重现程度验证方法一n 操作要求：（可同方法准确度，线性验证同时运行）a）配制被测物标准品溶液，进样确认rsd%结果。（如和系统适应性同天测试可以使用系统适应性结果。）b）用被测物标准品定量称样

13、并配制成相对含量为80%，100%与120%三种测试溶液。每个溶液配制3份。（每个浓度点，每份溶液均应单独称取配制。）c）每个样品最少测定2次。计算每个样品峰面积的平均值。（如连续进样3针，可以计算rsd%，并验证系统精密度。）d）计算每个浓度点的3份溶液的含量及相应的rsd%。e）计算每个浓度点的平均含量及3个点间的rsd%。n 预期标准： 每个浓度点含量结果的rsd%及3个浓度点间含量结果的rsd%均不大于#%。n 报告要求：a）记录标准溶液中被测物峰面积，计算平均值与rsd%。b）计算在每个溶液的含量及每个浓度点的平均含量，计算相应的rsd%。表5、方法精密度测试结果相对浓度80%100

14、%120%称样峰面积测试1测试2测试3平均值rsd%含量rsd%平均含量rsd%验证方法二n 操作要求：a）配制被测物标准品浓度，进样确认rsd%结果。（如和系统适应性同天测试可以使用系统适应性结果。）b）用被测物标准品定量称样并配制成相对含量为100%的测试溶液，共6份。 每份溶液均应单独称样配制。c）每个样品最少测定2次。计算每个样品峰面积的平均值。d）计算6份溶液的含量及相应的rsd%。n 预期标准：6份溶液含量及相应的rsd%均不大于#%。n 报告要求：a）记录标准溶液中被测物峰面积，计算平均值与rsd%。b）计算在每份溶液中含量及相应的rsd%。表6、方法精密度测试结果称样峰面积测试

15、1测试2平均值rsd%含量平均含量rsd%9、 验证范围内的线性测定规程与预期标准n 目的： 确定在80%到120%的范围内，被测物的测试结果与浓度之间的线性关系。n 操作要求：（可同方法准确度，方法精密度验证同时运行）a）用被测物标准品定量称样并配制成相对含量为80%，90%，90%，100%，110%与120%五种测试溶液。（每个浓度点，每份溶液均应单独称样配制。）b）每个样品最少测定2次。计算每个样品峰面积的平均值及每个浓度点的峰面积平均值。c）以样品平均浓度对相应平均峰面积做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。n 预期标准： 相关系数应大于#。n 报告要求： 应报告线性方程、线

16、性图谱。表7、线性结果浓度相对浓度峰面积1峰面积2峰面积3平均峰面积平均值回归方程相关系数10、 验证范围内的方法准确度测定规程与预期标准n 目的： 确定该色谱方法在100%测试点以及线性范围（80%-120%）内的测定结果与真实值（理论量）的差异。从而确认是否该方法可以获得准确的测试结果。n 操作要求：（可同方法精密度验证一，线性验证同时运行）a）配制被测物标准品溶液，进样确认rsd%结果。（如和系统适应性同天测试可以使用系统适应行结果。）b）用被测物标准品定量称样并配制成相对含量为80%，100%与120%五种测试溶液。每个溶液配制3份。（每个浓度点，每份溶液均应单独称样配制。）c）每个样

17、品最少测定2次。计算每个样品峰面积的平均值。d）计算每个样品溶液的平均含量，并计算3个浓度点的9个溶液的总平均浓度值与大于95%的置信区间。（或可以使用回收率的概念来验证）n 预期标准： 样品真实值（100%）应包括在测试结果的大于95%置信区间内。n 报告要求：a）记录标准溶液中被测物峰面积，计算平均值与rsd%。b）记录在每个浓度点下被测物峰面积，计算每个测试的被测物含量。计算每个浓度点的平均值以及相应的sd与大于95%的置信区间。表8、方法准确度测试结果相对浓度80%100%120称样峰面积测试1测试2测试3平均含量平均含量sd大于95%置信区间真实含量100%注：大于95%置信区间计算

18、公式： x:样品的平均值。sd：样品的标准偏差。n：样品数，此时为9。如样品值（n）改变，2.628应依照t检验表进行修订。11、方法中间精密度测定规程与预期标准：n 目的： 研究在同一实验室中在不同的时间内，不同的仪器上，以及被不同的人员测试行同样品结果的重现程度。n 操作要求：使用标准品或一个批号的样品，按含量测试的要求准备相应的样品溶液和标准品溶液，按如下要求进行测试（每个样品最少2份，每份测试2次）n 连续三天测试（样品与标准品溶液每天重新配制）n 两台不同型号或不同制造商的高效液相色谱仪上测试。n 二个以上不同的分析人员分别测试。（以上三条可以根据实际情况增减，或组合运行）根据正交表

19、规则，如果组合欲行，可以按如下进行，测试6次即可。设人的代码为a、b;仪器的代码为、，则可以如下安排：n 第一天：a， b，（即第一个人用第一台仪器测试样品，第二个人用第二台仪器测试样品）n 第二天：a， b，n 第三天：a， b，a）计算每次测试的平均含量结果以及相同条件下结果的相对标准偏差或标准偏差。n 预期标准： 同一条件下三次测试结果的相对标准偏差（rsd%）或两次测试的相对偏差（pd%）均应不大于#%。n 报告要求： a）按要求测试样品，计算每次测试样品含量平均值。 b）计算每个测试条件的含量结果的均值与rsd%或相对偏差，应不大于#%。表9、含量测试结果日期人员仪器平均含量1a1b

20、2a2b3a3b表10、中间精密度验证结果测试条件不同条件下含量结果平均总平均rsd%或相对偏差日期第一天第二天第三天人员人员a人员b仪器仪器仪器另：如果人员，仪器条件均不能满足，即只有一个人员，一台仪器用于中间精密度验证时，可以使用以下方法：n 操作要求： a）使用3批不同批号的样品，按含量测试的要求准备相应的样品溶液和标准品溶液，按如下要求进行测试（每次测试最少2份，每份测试2次）。 b）连续三天测试（样品与标准品溶液每天重新配制） c）计算每批样品每天测试的平均含量结果以及3天含量结果的rsd%。n 预期标准： 同一批号样品连续3天测试的相对标准偏差（rsd%）应不大于#%。n 报告要求

21、： 计算同一样品3天测试含量结果的均值与rsd%.应不大于#%。表11 中间精密度测试结果样品含量平均含量rsd%第一天第二天第三天12312方法耐用性测定规程与预期标准（仅在新开发的方法的第一次验证时运行该项目）n 目的： 确认在测定条件有微小变动时，测定结果不受影像的程度。n 操作要求： 在对色谱系统进行微小的变动后，测试样品并运行系统适应性中的相关测试。（主要是分离度）。观测在微小变动后色谱系统对杂质的分离测试情况及系统适应性符合情况。微小变动情况： 被测溶液稳定性 样品提取次数、时间 hplc:流动相组成、流动相ph值、不同品牌或不同批号的同类色谱柱、柱温、柱流速等。gc : 不同品牌

22、或不同批号的色谱柱、柱温、柱流速等。附：极限调整范围：hplc：流动相ph：0.2ph单位 流动相缓冲盐浓度：10% 流动相中有机相比例：30% 柱流速：50%柱温： 20gc：柱温：2%升温程序：20%柱流速：最多50%（以上变动情况根据实际条件有选择进行，但溶液稳定性必须验证。）n 预期标准： 相邻的已知杂质以及主峰均可以达到基本分离。 系统适应性中的分离度测试符合相应的标准n 报告要求：溶液稳定性：报告被测物溶液稳定性时间。其他项目：报告分离度情况。例：a） 溶液稳定性：用被测物标准品准备标准溶液及样品溶液，按如时间下点测试。时间点：0（初始点），2小时，4小时，8小时，24小时，如有必

23、要可以继续运行。（可以根据实际情况修订，但必须测试24小时以上。）用面积归一化法测试并计算每个时间点杂质结果及相应的变化。用外标法测试并计算每个时间点含量的结果及相应变化。如样品溶液不稳定应考虑避光及冷藏条件下的溶液稳定性。n 预期标准：根据实际情况确定可以接受的杂质及含量变化的限度。当其在设定的时间点内的变化小于预定的限度时，设定的时间范围为样品溶液稳定性范围。当在设定时间点中的某一点的杂质或含量变化大于预定的限度时，改点的前一时间点为样品溶液稳定性范围。n 报告要求：计算在不同时间点被测物含量与杂质相应的变化情况。并报告被测物溶液稳定性时间。 表12、溶液稳定性测试表设定时间杂质结果主峰杂

24、质结果含量rrt=rrt=rrt=rrt=rrt=rrt=024824由上可知，被测物溶液稳定时间为 小时b） 流动相ph的变化准备典型的被测物样品溶液及系统适应性溶液。分别使用正常流动相，预定测试的另2个流动相测试，待仪器系统稳定后分别测试系统适应性溶液剂样品溶液。记录相邻已知杂质间及主峰与相邻杂质间的分离度、及系统适应性中的分离度结果。n 预期标准： 相邻已知杂质间及主峰与相邻杂质间应达到基本分离度。 系统适应性中的分离度结果符合系统适应性要求。n 报告要求： 报告相应的分离度结果 表13、流动相ph变化耐用性测试表流动相ph值主峰前杂质分离度主峰后杂质分离度系统适应性分离度3、附件三相关

25、物质测试方法的验证方案1、 需验证的测试方法色谱柱柱温柱流速进样量：检测波长样品稀释剂流动相标准品、样品、系统适应性溶液的配制过程2、 验证所使用的仪器条件名称型号序列号供应商高效液相色谱进样器泵柱温箱（如有）检测器色谱工作站色谱柱3、 验证使用的试剂与标准品名称规格批号供应商4、 系统适应性测试与标准（如没有要求不需要运行，如与含量方法相同不需要运行）n 目的： 确认用该仪器系统运行含量测试方法的验证是否符合要求。n 操作要求: 按照系统适应性测试方法的要求配制被测物的标准溶液进行，计算峰面积的rsd%。 配制系统适应性测试溶液进样，计算相应组分的分离度、拖尾因子及柱效。n 标准：（方法规定

26、的系统适应性标准） rsd% 拖尾因子 柱效 分离度n 报告要求:记录被测物峰面积计算rsd%并报告结果（如下表）计算分离度，如工作站可以直接打印相应的报告，则应附含有该报告的图谱。如需手工计算应报告图例，测量的数据，计算公式及相应的计算结果。表1、系统适应性测试结果进样次数保留时间（min）峰面积rsd%-5、 方法专属性测定规程与预期标准(与含量测试方法验证中相同项目可以不必运行)n 目的 确定该方法可以完全分离所有的已知杂质与潜在杂质，且被测杂质的测定不受干扰n 操作要求 a）单独进样样品稀释剂溶液，证明该溶液对样品测试无干扰。 b）配制被测杂质溶液进样，确定保留时间。 c）单独配制可以

27、获得的原料、中间体，副反应产物及药物主成分。单独进样确认保留时间。 d）配制含被测物，原料，中间体，副反应产物标准品的混合溶液。进样并计算分离度以确保所有已知杂质对被测物的测试无干扰。 e）将已知杂质添加到含药物主成分的溶液中，确认其对杂质测试无干扰。如可能，运行添加后已知杂质的纯度测试。n 预期标准a）稀释剂空白对样品测试无干扰b）所有原料，中间体与副反应产物与药品主成分不干扰被测物测定。其相邻组分分离度均大于1.5。c）添加后已知杂质纯度符合要求。（需自定）。n 报告要求记录相应的保留时间，计算并报告分离度结果。表2、方法专属性-原料，中间体与副反应结果名称保留时间分离度1.56、 系统精

28、密度测定规程与预期标准（如系统适应性中无rsd%要求则不需要运行，如系统适应性要求与含量方法相同不需要运行）n 目的： 测定在稳定的液相色谱条件下，被测物溶液多次测量结果之间的接近程度，即色谱系统的稳定程度。n 操作要求：（可同系统适应性一同完成）标准测试方法配制被测物标准溶液，连续进样6针，计算被测物主峰保留时间及峰面积的rsd%。n 预期标准： 被测物主峰保留时间及峰面积的相对标准偏差（rsd%）。不超过设定值。n 报告要求： 记录被测物峰面积及保留时间，计算rsd%并报告结果（如下表）表3系统精密度测试结果进样次数保留时间（min）峰面积123456rsd%7、 最小检测限测定规程与预期

29、标准 （需验证已知杂质及药物主成分的lod）n 目的： 确定在该色谱条件下，被测物可以被检出的最低量。n 操作要求：以样品稀释溶剂为空白，调整仪器的灵敏度，连续进样3次，记录在被测物出峰时间范围内的仪器噪声水平。计算平均噪声。准确配制被测物标准溶液，逐步稀释至一定浓度并进样。计算其峰高与噪声的比值（信噪比），其信噪比（s/n）在3左右的样品浓度即为最小检测浓度，其相对于理论样品浓度的比值为最小检测值。（最少测定2次）。n 报告要求：记录被测物峰面积及保留时间，并报告结果。表4 噪声数据空白噪声1噪声2噪声3噪声4样品稀释剂表5 最小检测限数据化合物名称浓度（mg/ml保留时间（min）峰高平均

30、噪声s/n检测限（%或ppm）8.方法定量限测定规程与预期标准 （需验证已知杂质及药物主成分的loo）n 目的：确定在该色谱条件下，被测物可以被准确定量的最低限度。n 操作要求：按含量的以样品稀释溶剂为空白，调整仪器的灵敏度，连续进样3次，记录在被测物出峰时间范围内的仪器的噪声水平。计算平均噪声。准确配制被测物标准品溶液，逐步稀释至一定浓度并进样。计算其峰高与噪声的比值（信噪比），其信噪比（s/n）在100.5的样品浓度即为定量限浓度,其相对于理论样品浓度的比值为定量限.(最少测3次)n 报告要求:记录被物峰面积及保留时间,并报告结果.表6 定量限数据化合物名称浓度(mg/ml)保留时间(mi

31、n)峰高平均噪声s/n检测限(%或ppm)9. 预期的验证范围根据杂质测试的具体要求和情况,确定其预期的验证范围应为:已知杂质的loq或相对含量为0.1%中较大的值-杂质标准的120%,其为#mg/ml-#mg/ml(如考虑样品中含有已知杂质的情况范围应扩大到全部覆盖准确度验证中可能达到的浓度范围。)10. 验证范围内的方法精密度测定规程与预期标准(已知杂质未检出不需要验证)n 目的：确定对于相同样品多次称样测量结果的重现程度n 操作要求：a) 配制被测杂质标准品溶液,进样确认rsd%结果。(如和系统适应性同天测试可以使用系统适用性结果。)b) 选择一批有代表性的药物主成分样品,按照杂质纯度方

32、法准备相应的测试溶液.共单独配制6份。c) 每个样品溶液最少测定2次.计算每个样品溶液中已知杂质的含量及平均值。d) 计算6份溶液中已知杂质含量及相应的rsd%。n 预期标准:已知杂质含量结果的rsd%均不大于#%。n 报告要求:a) 记录标准溶液峰面积,计算平均值与rsd%。b) 计算在每份溶液的平均含量及6个溶液相应的rsd%。表7、方法精密度测试结果编号样品浓度（mg/ml）杂质1（%）杂质2（%）杂质3（%）杂质4（%）123456平均值rsd%11、 验证范围内的线性测定规程与预期标准（当某个已知杂质标准品不可得时，应验证药物主成分在相应范围内的线性关系来代表该杂质的相应线性情况（认

33、为该杂质的rrf为1）n 目的： 确定在预先设定的范围内，已知杂质（或药物主要成分）的测试结果与浓度之间的线性关系。n 操作要求：a）在预先确定的待验证的范围内选择合适间隔的样品测试点。最少5点，并应包括标准点，范围的最低点及最高点。b）用已知杂质或药物主成分标准品定量称样并配制成相应的储备溶液。c）用储备溶液定量稀释到预先设定的5个测试浓度。d）每个浓度点最少测定2次。计算每个浓度点的峰面积平均值。e）以样品浓度（或相对含量）对相应平均峰面积做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。n 预期标准： 相关系数应大于#。n 报告要求： 应报告线性方程、线性图谱。（如下表）表8 线性结果浓度相

34、对浓度峰面积1峰面积2平均峰面积回归方程相关系数12.验证范围内的方法准确度测定规程与预期标准（已知杂质标准品可得时用加样回收率来验证，如此时使用药物主成分自身对照法及面积归一化法来监控该杂质，应同时测定该杂质的相对响应因子（rrf）,当某个已知杂质标准品不可得时不需验证）n 目的： 确定该色谱方法在已知杂质的loq或相对含量为0.1%中较大的值到杂质标准的120%范围内的测定结果与真实值（添加量）的差异。从而确认是否该方法可以获得准确的测试结果。a回收率测定n 操作要求：a）选择已知杂质的loq或相对含量为0.1%中较大值的相应点，杂质标准（100%）及杂质标准的120%3个点。b）选择一批

35、有代表性的药物主要分样品，定量称样12份，并配制成杂质测试样品溶液。c）用已知杂质标准品定量称样并配制成相应的储备溶液。d）在12份杂质测试溶液中选择9份溶液分别定量添加（a）相中选择的3个浓度的标准溶液，每个溶液添加3份，制成准确度验证时样品溶液。另外3份作为空白对照。e）每个浓度点最少测定2次。计算每个浓度点的已知杂质的平均含量。f）对于每个浓度点，计算相应的加样回收率。（可用实际杂质测试含量扣除空白溶液中杂质含量的结果与加样量的比值来计算，或用实际杂质测试含量除以空白溶液中杂质含量与加样量之和来计算。）n 预期标准： 加样回收率在#%-#%之间。n 报告要求：a）记录标准溶液中峰面积，计

36、算平均值与rsd%。b）记录在每个浓度点（包括空白）被测杂质峰面积，计算每个被测杂质的含量。计算每个浓度点的加样回收率。表9,方法准确度测试结果添加浓度相对含量测试结果回收率峰面积1峰面积2平均峰面积平均含量(空白对照)loq100%200%b,相对响应因子(rrf)的测定n 操作要求a)在已知杂物及药物主成分的loq或相对含量为0.1%中较大的值到杂质标准的120%范围内选择合适间隔的样品测试点.最少5点,并应包括杂质标准点,范围的最低点及最高点。b)用已知杂质与药物主成分标准品定量称样并配制成含有1:1比例的已知杂质药物主成分混合储备溶液,单独配制至少2份。c)按照所选择的测试点将分别将2

37、个混合储备液定量稀释成合适的测试溶液。d)每个溶液至少测定2次。e)计算每个溶液已知杂质相应的rrf值。f)在相应的相对偏差及rsd%均符合的情况下,计算所有rrf的平均值即为已知杂质的rrf(相对响应因子)。n 报告要求a)记录溶液中已知杂质与药物主成分的峰面积,并计算rrf。b)计算同浓度的两份溶液间的rrf值偏差,5个浓度间rrf值的rsd%。c)在相对偏差及rsd%均符合的情况下,计算并报告rrf的平均值为已知杂质的rrf(相对响应因子)。表10 rrf测试结果相对浓度样品溶液1212121212rrf结果平均值相对偏差平均rrfrsd%13.方法中间精密度测定规程与预期标准 (已知杂

38、质未检出不需要验证)l 目的:研究在同一实验室中在不同的时间内,不同的仪器上,以及被不同的人员测试相同样品结果的重现程度。l 操作要求:使用一个有代表性的样品,按杂质测试的要求准备相应的样品溶液和标准品溶液,按如下要求进行测试(最次测试最少2份,每份测试2次)。n 连续三天测试(样品与标准品溶液每天重新配制)。n 两台不同型号或不同制造商的高效液相争谱仪上测试。n 两个以上不同的分析人员分别测试。(以上三条可根据实际情况增减,或组合进行,具体参见含量测试方法验证中的中间精密度验证项)。l 预期标准：同一条件下三次测试结果的相对标准偏差(rsd%)或两次测试的相对偏差(pd%)均应不大于#%。l

39、 报告要求a) 按要求测试样品,计算每次测试样品含量平均值。b) 计算每个测试条件的含量结果的均值与rsd%或相对偏差,应不大于#%。表11 杂质测试结果日期人员仪器平均含量1a1b2a2b3a3b表12，中间精密度验证结果测试条件不同条件下含量结果平均总平均rsd%或相对偏差日期第1天第2天第3天人员人员a人员b仪器仪器a仪器b另：如果人员，仪器条件均不能满足，即只有一个人员，一台仪器用于中间精密度验证时，可以使用以下方法。n 操作要求：a)选择3个不同批号的有代表性的样品，按杂质测试的要求准备相应的样品溶液和标准溶液，按如下要求进行测试（每次测度最少2份，每份测试2次）。b）连续3天测试（

40、样品与标准溶液每天重新配制）。c)计算每批样品每天测试的平均含量结果以及3天含量结果的rsd%。n 预期标准： 同一批样品连续3天测试的相对标准偏差（rsd%）应不大于#%。n 报告要求：计算同一样品3天测试含量结果的均值与rsd%，应不大于#%。表13 中间精密度测试结果样品杂质含量平均含量rsd%第1天第2天第3天12314 方法耐用性测定规程与预期标准 （仅在新开发的方法的第一次验证时运行，与含量测试方法相同可以不必运行）l 目的：确认在测定条件有微小变动时，测定结果有不受影响的程度。l 操作要求：在对色谱系统进行微小的变动后，测试样品并运行系统适应性中的相关测试。（主要是分离度）。观测

41、在微小变动后色谱系统对杂质的分离测试情况及系统适应性符合情况。微小变动情况：被测溶液稳定性样品提取次数，时间hplc：流动相组成，流动相ph值，不同品牌或不同批号的同类色谱柱，柱温，柱流速等。gc：不同品牌或不同批号的色谱柱，柱温，柱流速等（以上变动情况根据实际情况有选择进行，但溶液稳定性必须验证）l 预期标准主峰与其相邻杂质可以达到基本分离。系统适应性的分离度测试符合相应的标准。l 报告要求 溶液稳定性：报告被测溶液稳定性时间。其它项目：报告分离度情况。l 具体验证过程与实例参见含量方法验证中方法耐用性验证的具体内容。4、附件四残留溶剂测试方法验证方案1 需验证的测试方法色谱柱固定相载气分流

42、比柱温程序柱流速或柱前压进样量检测器类型检测器温度进样器温度标准品，样品，系统适应性溶液的配制过程2 验证所使用的仪器条件名称型号序列号供应商气相色谱自动进样器气相色谱主机检测器色谱工作站色谱柱3 验证使用的试剂与标准品名称规格批号供应商4 系统适应性测试与标准l 目的：确认用该仪器系统运行残留溶剂含量测试方法的验证是否符合要求。l 操作要求：按照系统适应性测试方法的要求配制标准溶液进样5-6针计算峰面积的rsd%，相邻组分间的分离度，拖尾因子及柱效。l 标准：（方法规定的系统适应性标准）rsd%分离度拖尾因子柱效l 报告要求：记录相应溶液的峰面积计算rsd%并报告结果。（如下表）计算分离度，

43、拖尾因子及柱效，如工作站可以直接打印相应的报告，则应附含有该报告的图谱。如需手工计算应报告图例，测量的数据，计算公式及相应的计算结果。表1 系统适应性测试结果进样次数保留时间（min）峰面积rsd%5 方法专属性测定规程与预期标准l 目的：确定所需要测定的溶剂可以被该方法分离，且这些溶剂的测定不会受到来自溶媒及可能出现的杂质的干扰。l 操作要求：a) 单独进样稀释用的溶媒，证明该溶液对溶剂测试无干扰。b) 单独进样每一个需要测定的溶剂的标准品，确定其保留时间。c) 配制残留溶剂测定的标准品溶液（包含所有待测溶剂的混合溶液），进样并计算分离度以确认所有溶剂间无干扰。d) 将ros测定的标准溶液添

44、加到含待测药物的样品溶液中测试，确认可能出现的杂质（主要是药物总成分的降解杂质）对溶剂测试无干扰。如可能，使用不同的温度程序或不同的色谱柱来证明，如能用ms证明更佳。l 预期标准a) 稀释用溶媒对待测液无干扰。b) 所有相邻待测溶剂间及待测溶剂与溶媒主峰间的分离度均大于1.5。c) 在测试期间药物不会发生降解或降解物质不干扰待测溶剂的测定。l 报告要求记录相应的保留时间,计算并报告分离度结果.表2 方法专属性溶剂名称保留时间相邻溶剂间分离度6. 系统精密度测定规程与预期标准 (如系统适应性中的rsd%测试为6针进样结果,该项目可以直接采用其结果)l 目的:测定在稳定的色谱条件下,被测溶剂溶液多

45、次测量结果之间的接近程度,即色谱系统的稳定程度。l 操作要求：按照测试方法配制标准溶液,连续进样6针,计算被测溶剂主峰保留时间及峰面积的rsd%。l 预期标准被测溶剂主峰保留时间及峰面积的相对标准偏差(rsd%)不超过系统适应性规定值。l 报告要求记录被测溶剂峰面积及保留时间,计算rsd%并报告结果。(如下表)表3 系统精密度测试结果进样次数峰面积溶剂1溶剂2溶剂3溶剂4123456rsd%7.最小检测限测定规程与预期标准l 目的: 确定在该色谱条件下，被测溶剂可以检出的最低量。l 操作要求:以稀释溶媒为空白,调整仪器的灵敏度,连续进样3次,记录在被测溶剂出峰时间范围内的仪器的噪声水平。计算平

46、均噪声。准确配制被测溶剂标准溶液,逐步稀释至一定浓度并进样,计算其峰高与噪声的比值(信噪比),其信噪比(s/n)在3左右的样品浓度即为最小检测浓度,其相对于理论样品浓度的比值为最小检测限。(最少测定2次)l 报告要求:记录被测溶剂峰面积及保留时间,并报告结果.表4 噪声数据空白噪声1噪声2噪声3平均噪声样品稀释剂表5 最小检测限数据溶剂名称浓度(mg/ml)保留时间(min)峰高平均噪声s/n检测限(%或ppm)8方法定量限测定规程与预期标准l 目的： 确定在该色谱条件下，被测溶剂可以被准确定量的最低限度。l 操作要求： 按含量的以样品稀释溶剂为空白，高调整仪器的灵敏度，连续进样3次，记录在被测溶剂出峰时间范围内的仪器的噪声水平。计算平均噪声。准确配制被测溶剂标准品溶液，逐步稀释至一定浓度并进样。计算其峰高与噪声的比值（信噪比），其信噪比（s/n）在100.5的样品浓度即为定量限浓度,其相对于理论样品浓度的经值为定量限。(最少测定3次)l 报告要求: 记录被测溶剂峰面积及保留时间,并报告结果.表6 定量限数据溶剂名称浓度(mg/ml)保留时间(