发酵实验报告

1、发酵工程原理综合实验小型发酵罐的使用与发酵过程监测与分析学院名称：食品学院年级专业：09级生物工程实验日期2011.11.23-25摘 要发酵罐是用于培养微生物或细胞的封闭容器或生物反应装置。可用于研究、分析或生产。有多种在材料、大小和形状上各异的产品。最常用的为全搅拌罐式反应器。发酵罐广泛应用于乳制品、饮料、生物工程、制药、精细化工等行业，罐体设有夹层、保温层、可加热、冷却、保温。罐体与上下填充头（或雏形）均采用旋压r角加工，罐内壁经镜面抛光处理，无卫生死角，而全封闭设计确保物料始终处一无污染的状态下混合、发酵，设备配备空气呼吸孔，cip清洗喷头，人孔等装置。本实验通过控制合适的培养条件，使

2、大肠杆菌迅速持续生长，在发酵过程中定时取样测定不同时期发酵液的细菌浊度及残留还原糖的变化了解发酵过程中菌体生长及对培养基的利用情况。关键词：大肠杆菌 液体发酵 最大比生长速率 平均细胞得率系数目 录前 言41 材料与设备41.1 材料41.1.1 菌种41.1.2 培养基41.1.3 其他材料41.2 设备52 实验方法52.1 流程52.2 菌种准备52.2.1 配制培养基52.2.2 接种与培养52.3 上罐前的准备62.4 实罐灭菌62.5 发酵操作72.5.1 取样72.5.2 接种72.5.3 电脑监控72.5.4 发酵管理72.6 发酵过程中各项生理指标的测定72.6.1 od值测

3、定72.6.2 葡萄糖测定82.7 放罐清洗93 结果与分析93.1 菌体浓度与吸光值关系标准曲线93.2 发酵过程各参数变化规律93.2.1干菌体浓度93.2.2 葡萄糖浓度103.2.3 ph值、do值和其他一些参数113.3 各参数整理与分析113.4 最大比生长速率133.5 平均细胞得率系数153.6实验操作对实验结果的影响153.6.1 菌种活化与一级菌种、二级菌种的制备153.6.2 摇床153.6.3 上罐前管理153.6.4 实罐灭菌163.6.5 接种时管理163.6.6 发酵时管理163.6.7 od值测定173.6.8 还原糖测定173.6.9 试验中遇到的问题及猜想1

4、7参 考 文 献18前 言发酵罐是进行液体发酵的专用设备。实验室使用的小型发酵罐，其体积可从1l至数百升。一般5l以下是用耐压玻璃制作罐体，10l以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备控制系统，它主要是对发酵过程中的各种参数如温度、ph、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。大肠杆菌（e.coli）是遗传工程研究过程中常用的受体菌，对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究已相当彻底，已有很多不同抗药性、不同营养依赖型和不同校正突变型的菌种供选择应用，可以根据不同的载体而选择不同的菌种。大肠杆菌在营养条件充足时，2030min即可繁殖一代，而

5、且大规模发酵成本低，具有巨大的生产潜力为了解发酵过程中菌体的生长及对培养基的利用情况，需在发酵过程中定时地取样测定。包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的细菌浊度及残留还原糖（rg）的变化等。1 材料与设备1.1 材料1.1.1 菌种大肠杆菌（e.coli）1.1.2 培养基种子培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，氯化钠5g，水1000ml。ph7.0。发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏10g，氯化钠5g，氯化铵5g，水1000ml。ph7.0。全部用自来水配制培养基。1.1.3 其他材料泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化

6、钠等。1.2 设备biotech-7bgz发酵罐1套（配套蠕动泵、ph电极、溶氧(do)电极、空压机及所有连接管）、分光光度计、旋转式摇床、离心机、恒温培养箱等。2 实验方法2.1 流程图1 发酵过程流程2.2 菌种准备2.2.1 配制培养基配制种子固体培养基100ml，分装试管，0.1mpa（121）灭菌20min，摆成斜面。配制种子培养液600ml，分别分装50ml于两个250ml三角瓶中（作一级种子瓶），余下550ml平均分装于三个500ml三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌备用。2.2.2 接种与培养2.2.2.1 菌种活化上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37培养24h。2.2.

7、2.2 接一级种上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37振荡（125r/min）培养12h。分别测接种前和培养结束时的od值，计算出净增od，并作记录。2.2.2.3 接二级种将一级种转接二级种子，接种量5%。之后，37振荡（125r/min）培养10h。2.3 上罐前的准备洗净发酵罐及各联接胶管。配制发酵培养基5000ml，置发酵罐内，加入几滴泡敌。校正ph电极和溶氧(do)电极。安装好发酵罐，把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀v2、w1，使夹套充满水。2.4 实罐灭菌用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀v4，启动蒸气发生器

8、，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀v1，开启蒸气阀门s1，进行在位灭菌。当保护罩顶部阀门v4有蒸气排出时，2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀v4适当排气，并调整蒸气阀s1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀s1，全开冷凝水出水阀v1，开进水阀w3，将温度设定在37，切入自动。灭菌完成后，关闭蒸汽发生器并排去蒸汽发生器内残汽。当温度降到100以下，缓缓开排气阀v4，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。连接通气管路，将进气过滤器k7口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源，对发酵罐进行通气，调整空气流量35l/min。温度达到37时，将预先灭菌的ph

9、电极、do电极（75%酒精消毒、uv消毒）接入发酵罐，连接各电极导线。流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。 设定搅拌转速为300r/min、空气流量23l/min、ph7.0、do100%，系统进入发酵状态。开启电脑，并与发酵罐主控设备相联。打开控制软件，做好实时监控和记录发酵全过程的准备。2.5 发酵操作2.5.1 取样当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，开始取样（用于接种前培养基成分分析）：松开弹簧夹j2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧j2

10、，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹j3，发酵液被压入接料瓶，开j2、j3排出取样管内残料，夹紧j2、j3。2.5.2 接种将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定发酵液零时od值。2.5.3 电脑监控打开电脑，启动软件，进行实时监控。2.5.4 发酵管理注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。(例：当在某一时段泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可用手动加入几滴消泡剂)每小时取一次样，每次取样50ml。取样时，用量筒准确取流出的培养液50ml, 对号

11、倒入三角瓶中，封口，立即放入冰箱保存。每小时记录发酵过程温度、ph、do、通风、转速的数值，并记录操作情况。2.6 发酵过程中各项生理指标的测定2.6.1 od值测定均匀取样品5ml于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在721分光光度计上测定a600，根据菌体浓度与吸光度之间关系的标准曲线换算出菌体浓度。其余发酵液于2000r/min条件下离心分离8min，上清液入编号三角瓶，用于测糖。2.6.2 葡萄糖测定2.6.2.1 样品处理用蒸馏水对样品液进行稀释待用。2.6.2.2 标定碱性酒石酸铜溶液分别吸取5.0ml碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2

12、粒，混匀，从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10ml（甲、乙液各5ml）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。2.6.2.3 样品溶液预标定分别吸取5.0ml碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，混匀，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。

13、2.6.2.4 样品溶液测定分别吸取5.0ml碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少1ml的样品溶液，使在2min内加热至沸腾，趁沸继续以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积。2.6.2.5 结果计算还原糖（以葡萄糖计，g/l）= c v n / v1式中：c 葡萄糖标准溶液的浓度，mg/ml；v 标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，ml；v1测定时平均消耗样品溶液体积，ml；n 被测样品稀释倍数。2.7 放罐清洗经过发酵约8-10h后，菌量

14、增长（od）值缓慢时，便可放罐，放罐操作同取样。排放液需经灭菌(煮沸)处理才可进入下水道。放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源。3 结果与分析3.1 菌体浓度与吸光值关系标准曲线大肠杆菌干菌体浓度y（g/l）与菌液od值x之间的关系：y = 0.8433 x0.0773得菌体浓度与对应吸光值如表1。表1 菌液浓度对应的od值菌液od值（g/l）稀释后干菌体浓度（g/l）0.3520.220 0.2970.173 0.5460.383 0.6520.473 0.7950.593 0.7750.576 0.7640.567 0.6550.475 0.6650.483 0.7480.553 0.5

15、790.411 3.2 发酵过程各参数变化规律3.2.1干菌体浓度发酵过程中各样品od值已经代入标准曲线计算得到的干菌体浓度记录如表2。表2 样品od值以及计算结果编号稀释倍数菌液od值 x稀释后干菌体浓度 y（g/l）实际干菌体浓度 y(g/l)000.3520.220 0.220 140.2970.173 0.693 250.5460.383 1.916 350.6520.473 2.363 450.7950.593 2.966 560.7750.576 3.458 670.7640.567 3.969 790.6550.475 4.276 890.6650.483 4.351 9100.

16、7480.553 5.535 10120.5790.411 4.932 3.2.2 葡萄糖浓度滴定葡萄糖的数据及计算结果如表3。表3 葡萄糖滴定体积以及计算结果发酵时间/h预滴定/ml正式滴定/ml平均值稀释倍数葡萄糖含量123标定9.30 10.10 10.80 10.40 10.43 10.4308.12 9.72 9.62 9.82 9.72 1819.31 17.31 8.63 8.93 8.92 8.83 1517.72 26.42 6.25 6.35 7.15 6.58 12.519.80 37.31 8.06 7.43 7.86 7.78 1013.40 46.24 7.62 7

17、.63 7.52 7.59 79.62 55.42 6.03 5.90 5.44 5.79 59.01 64.81 4.52 4.57 4.49 4.53 36.91 73.73 3.43 3.89 3.76 3.69 25.65 85.22 5.24 4.62 5.62 5.16 15.16 95.62 6.13 6.25 6.15 6.18 16.18 106.02 6.83 7.54 6.75 7.04 17.04 备注：后3个为反滴定结果3.2.3 ph值、do值和其他一些参数发酵过程中仪表盘上ph值、do值记录如表4。表4 ph值和do值样品0123456789ph7.416.957

18、6.96.936.956.986.986.986.98do %33.548.544.746.438.537.657.140.230.229.3发酵过程中温度维持在36.836.9范围内，通风量为3.5l/min，转速为299r/min。3.3 各参数整理与分析由于干菌体浓度（g/l）、葡萄糖浓度（g/l）、ph值、do值等数据的数值范围相差较远，难以在同一个坐标图中综合分析，故根据发酵过程中表2的干菌体浓度（g/l）、表3的葡萄糖浓度（g/l），表4的ph值和do值等数据结果，整理成表5。表5 发酵过程各参数整理结果样品发酵时间干菌体浓度（g/l）还原糖含量(g/l)ph菌液do（%）菌液do

19、/300.22019.317.4133.511.1710.69317.726.9548.516.1721.91619.80744.714.9032.36313.406.946.415.4742.9669.626.9338.512.8353.4589.016.9537.612.5363.9696.916.9857.119.0374.2765.656.9840.213.4084.3515.166.9830.210.0795.5356.186.9829.39.77根据表5，以发酵时间h为横坐标，以干菌体浓度（0.1）、葡萄糖浓度（1/6） 、ph（1/12）、do%等为纵坐标，绘制得到发酵过程中各参

20、数的变化规律的坐标图即图3。图3 大肠杆菌生长各参数变化规律大肠杆菌经过9个小时的分批发酵培养，发酵过程中干菌体浓度（g/l）、葡萄糖浓度（g/l ）、ph值、do/3（%）等参数的变化规律曲线如图3所示，可以分为3个阶段：第一个阶段：大肠杆菌生长的对数生长期是1h到6h。可以从图3看出：1.干菌体浓度曲线在1h到5h内上升明显，大肠杆菌代谢旺盛，菌体快速生长，细菌很少死亡或不死亡，增长速度呈对数生长。2.葡萄糖浓度曲线在0h至1h就开始下降，之后1h到2h上升了（估计是由于实验操作引起的误差），但仍然一直保持急剧下降的趋势，说明大肠杆菌在代谢过程中，消耗大量葡萄糖。3.do值曲线在1h到5h

21、内急剧下降，说明大肠杆菌生长和代谢旺盛，需氧量急剧上升。第二个阶段：大肠杆菌生长的稳定期是5h到9h。从图3可知：1.菌体浓度曲线在5h后应该会上升趋于平缓，推断此时生长速率下降，死亡率上升，活细胞数达到最大值，新生的细菌数和死亡的细菌数相当。2.由于葡萄糖浓度5h到8h继续下降，但8h到9h反而上升，估计是操作失误。3. do值在5h到6h又迅速恢复到甚至超过下降前的水平，这是可能由于葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升；或者是实验操作失误。6h之后又迅速降低，是由于菌体浓度很高，仍然需要大量供氧来代谢生长。ph值对发酵的影响：影响基质水解、酶活性、代谢方向，ph不

22、同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。若不控制ph值，在发酵过程中，葡萄糖的代谢分解成酸和醇，使ph下降，氮的代谢和产物的酸性也会使ph下降，从而影响发酵效果，故应严格控制好ph，该实验中ph控制在7.0。温度对发酵的影响：温度通过影响微生物的酶反应速度、发酵液中溶解氧而影响发酵；温度还能影响酶系组成及酶的特性、以及生物合成方向；温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制，可根据大肠杆菌菌种的生长阶段和培养条件综合考虑，以及发酵大肠杆菌的长期经验考虑，设定该实验发酵大肠杆菌的最适温度是37，本实验温度已严格控

23、制在最适温度要求范围内。通风和搅拌的剧烈程度对发酵的影响：影响着泡沫的形成。通风和搅拌程度小，会使发酵液的溶氧量下降，影响后续发酵；通风和搅拌程度大，则易生成泡沫，而增加染菌的机会，使菌体提早自溶，导致菌体产量下降，故应严格控制通风和搅拌的程度，该实验中，通风量是3.5l/min，搅拌器的转速是299 r/min。综合分析，在发酵过程中，应严格控制ph值、温度、do值、通风量、搅拌转速等发酵条件，从而发挥菌种的最大生产潜力，得到最大的比生产速率和最大的生产率。3.4 最大比生长速率分批培养是一种非恒态的培养法，分批培养中细胞的生长动力学： 其中：x干菌体浓度(g/l)t发酵时间(h) 比生长速

24、率(h-1)，即单位重量菌体的瞬时增量g/(gh)在对数生长阶段，细胞的生长不受限制，因此比生长速率达到最大值m：经积分后得： 干菌体浓度x与ln x关系如表6。表6 干菌体浓度x与ln x样品0123456789干菌体浓度x（g/l）0.6931.9162.3632.9663.4583.9694.2764.3515.5354.932ln x-0.3670.6500.8601.0871.2411.3781.4531.4711.7111.596由于比生长速率达到最大值是在对数生长期内，故取2h到8h这阶段的发酵时间与lnx的关系直线图，如图4。图4 发酵时间与lnx的关系直线图根据图4，取1h和

25、7h的lnx值，得1h时的lnx为0.4847，7h时lnx为1.5533ln（1.5533/0.4847）= m （7-1）即m = 0.1941g/(gh)3.5 平均细胞得率系数以消耗葡萄糖为基准的平均细胞得率yx/s ： 其中：yx/s相对于基质消耗的实际生长得率（g/mol或g/g)x干细胞的生长量（g）s基质的消耗量（mol或g）计算0h到9h内的细胞得率系数：yx/s = （4.932-0.693）/（19.31-5.65）=0.31g/g3.6实验操作对实验结果的影响3.6.1 菌种活化与一级菌种、二级菌种的制备发酵前的菌种如果活化不足，会令发酵罐培养中可以看到，菌体适应期会占

26、据比较大的比例；如果菌种活化过度，已经开始进入稳定期货衰退期，菌种活力不足，直接影响发酵质量，最后的平均细胞得率下降。如果发酵前菌种被污染，则可能整个曲线就不是大肠杆菌的生长变化曲线了。3.6.2 摇床摇床培养菌种有利于菌种在液体培养基中生长。通过调节转速和摇床的强度控制溶氧，有效控制一级菌种和二级菌种的质量。3.6.3 上罐前管理上罐前要把发酵罐洗净、确保各胶管连接好，否则会使发酵时参数不能及时调控，影响发酵质量。倒进培养基后，要注意校正培养基ph值、溶氧电极和滴入几滴泡敌。因为ph是菌种能否在最适环境下发酵的重要参数。若ph值不合适，将会影响菌种的生长发酵速度。而氧是微生物体内一系列细胞色

27、素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也是合成某些产物的基质。在发酵前期，溶氧量对菌种的生长发酵速度有重要影响。若培养基中溶氧不足，将会造成菌种生长滞缓，延长达到稳定期的时间。泡敌用于防止搅拌通风发酵产生大量气泡。3.6.4 实罐灭菌蒸汽进入夹层时，应同时打开排气口，充分排出罐内空气。灭菌过程进入罐内蒸气量要大，使取样口和底部阀门相连的管路内料液灭菌彻底，防止可能存在的死角；同时使罐内料液利用蒸气压力翻腾均匀，避免只有部分位置的翻动。灭菌到达规定时间后，应先关闭各排气口，后停止进入蒸气。3.6.5 接种时管理接种前对发酵液进行取样。接种操作要切忌感染杂菌。接种时，先把酒精棉圈置于接种口槽中，点燃

28、酒精棉，再旋开接种口。在火焰的保护下，先把接种瓶口灼烧杀菌，再匀速倒入二级种子。倒入种子时速度不能太慢，防止火焰热力把种子液体烤干杀灭菌种，或酒精燃烧熄灭导致菌种污染。旋紧接种盖，最后移去火焰圈。接种后要立即进行第一次取样，用于测定细菌的od值。若取样不及时，发酵罐内培养基中营养因为菌种的生长繁殖而下降，造成数据误差。取样时，要注意轻轻松开取样管的弹簧夹，用手捏住管嘴控制流速防止发酵液大量喷出，待样液缓缓流入接料瓶。当样液因气压问题不能流出时，轻捏取样管，待样液流出即可。取样结束先加紧控制流速的管，再夹紧取样管。每次取样前要先将上一次残留在取样管中的液体排出再进行取样。所有样品要做好标记放入冷库存放。特别注意取样后要立即把待测样液放入4冷库，防止菌种在室温下继续发酵，造成误差。3.6.6 发酵时管理每次取样前须记录相关的发酵指标参数，如温度、ph、do、通风量、转速等。发酵过程中要注意泡沫的量。泡沫产生的原因主要有：由外界引进的气流被机械地分散形式和发