Odyssey红外激光成像系统蛋白研究的多功能平台PPT学习课件

1、Western Blot 常见检测方法,化学显色法: 灵敏度低，无法定量 。 放射自显影法： 对身体有害，操作复杂。 化学发光法 : 无法精确定量，操作复杂。,抗原,一抗结合,红外荧光标记的二抗,Infrared dye (IRD800, Alexa680),ODYSSEY成像原理,INFRARED LASER DIODE,INFRARED APD DETECTOR,准确定量 Wide linear dynamic range 操作简便,直接检测 No film, darkroom, or messy substrates 灵敏度高 Equal to or better than chemil

2、uminescence 多色检测 Normalization increases quantification accuracy,Odyssey系统的特点,红外荧光准确定量,TIME,TIME,CHEMILUMINESCENCE 动态信号信号随时间变化 信号不与目标蛋白浓度成比例关系,ODYSSEY 静态信号信号不随时间变化 信号和目标蛋白浓度成比例关系,High concentration / signal,Medium concentration / signal,Low concentration / signal,0,0,0,0,INTENSITY,红外荧光定量WesternDEMO,

3、实验步骤,Odyssey: 膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像 ECL: 膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+ UVP扫描成像,实验目的 检测培养细胞转染外源基因的表达状况,红外荧光定量Western DEMO,Marker S1 S2 S3 S4,Marker S1 S2 S3 S4,Odyssey结果,ECL结果,信号强度 51 20 10 4,信号强度 302 62 30 19,（Odyssey软件分析结果）,结论,Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大 Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果 Odyssey扫描图能同时看到Marke

4、r 和目标蛋白，ECL看不到 Marker,10:4:2:1 稀释,红外荧光优点直接检测，操作简便,膜上抗原,一抗结合,红外标记的二抗,Odyssey直接扫描,不需要底物 不需要底片/暗室 信号持久,Odyssey VS ECL流程,红外荧光优点低背景,硝酸纤维, 聚偏氟乙稀（PVDF）,生物分子和尼龙等物质在可见荧光范围内有很高的自身荧光。,红外荧光 vs 可见荧光 膜背景信号,红外背景低、SN更高,Odyssey双色同时检测,800 nm,700 nm,Overlay,两套独立激发检测系统 700通道：680nm激发 720nm检测 800通道：780nm激发 820nm检测,应用一：双色

5、定量western检测,Target protein Anti-rabbit 800 channel,Normalizer target Anti-mouse 700 channel,* Two-color detection requires primary antibodies from different hosts,应用二：双色ERK的磷酸化,Anti-ERK,Anti-phospho ERK,Results Overlaid,Non-Stimulated,EGF-Stimulated,Non-Stimulated,EGF-Stimulated,Non-Stimulated,EGF-S

6、timulated,700 nm channel,800 nm channel,700 and 800 nm,观察EGF刺激后A431细胞中ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases)的磷酸化情况, 一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用 抗兔的IRDye800 标记的抗体 (green),和抗鼠的 Alexa680 标记的抗体 (red) ERK:胞外信号调节激酶 EGF:表皮生长因子,EMSA的简介,EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的

7、常用技术。 该技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当蛋白质与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白，一般为转录或调控因子。,EMSA,起初是用32P同位素标记寡核苷酸探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,从定购同位素到标记，做完试验,必须14天完成,既不安全也不方便； 地高辛标记探针的非放射EMSA实验技术，其缺陷是标记的探针纯化后灵敏度弱； 红外荧光素技术的出现，可以解决EMSA实验中的探针示踪问题，还可以进行双色标记，检测

8、竞争性结合。,应用三双色EMSA,Binding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).,700 and 800 Overlay,700 nm Channel,800 nm Channel,DNA-Protein Complex,Unbound DNA IRDye 800,Unbound DNA IRDye 700,Odyssey双色检测的优越性,双色输出，两个目标蛋白或核酸同时检测

9、，减少了工作量，而且杂交条件均等，便于两个数据的对比 杂交结果对比输出，结论更加直观，一目了然 可进行准确的量化分析,In-Cell Western Assay,The Odyssey In-Cell Western (ICW) Assay is a high-throughput approach to simultaneously detect and quantify two separate proteins directly within cells.,细胞培养 Culture cells to confluency in 96-well or 384-well plates,处理细

10、胞 Treat cells (inhibitor, stimulator, etc),固定细胞 Fix cells (3.7%formaldehyde, methanol or Prefer),透化细胞 Permeabilize cells (0.1%Triton-X 100),Odyssey系统扫描 Scan plate directly and analyze on the LI-COR Infrared Imaging Systems.,In-Cell Western 工作流程,Membrane Westerns vs ICW,EGF抑制剂对ERK磷酸化水平的影响,随着药物浓度的增加，蛋

11、白质的活性形式出现了变化。这样的技术平台对于药物的筛选和高通量信号转导通路的分析也是最佳选择。 ERK:胞外信号调节激酶 EGF:表皮生长因子,Odyssey的扩展应用,活体荧光检测 考马斯亮蓝凝胶分析 组织切片成像,活体动物成像,随着医学及生物学研究的飞速发展，越来越多的科研人员希望将分子及细胞生物学技术从传统的体外研究延伸到活体动物体内，以直接监控活体生物体内的细胞活动和基因表达，有效地研究观测转基因动物生理过程，譬如活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发生发展过程等。 活体动物光学成像技术作为新兴的成像技术以其操作简单、结果直观、灵敏度高、成本低等特点，成为活体动物成像的一种理想方法

12、。,活体动物成像,活体动物体内光学成像分为生物发光和荧光两种技术。 生物发光是利用荧光素酶基因标记目的核酸和细胞，在ATP和氧气存在时，通过荧光素酶催化注射进体内的底物荧光素，实现发光过程。 荧光技术则是采用荧光素或荧光素基因标记多肽、抗体、小分子药物，在外界光源的激发下产生荧光。 而传统荧光技术作为临床研究潜在的有力工具，自身的生物发光信号远弱于荧光信号，而且光在体内的传播会被散播和吸收，需要高灵敏度的检测仪器，成本非常昂贵。同时，发光几乎都是酶-底物类型的反应，需要涉及不同种类转基因细胞株或转基因动物模型，复杂程度较高，所以和荧光技术相比，更容易受反应体系中的成分影响。 不足在阻碍了在活体

13、动物体内成像的应用。,传统荧光技术的缺陷,1. 自发荧光干扰：在可见光激发光源下，活体小动物通常会产生较强的自发荧光，自发荧光主要是来源于皮毛(黑色素)和血液(血红蛋白)。 2. 光的组织吸收：荧光成像时，光在动物组织内传播时会被折射和吸收，而且不同类型的细胞和组织对光子的吸收能力不同。这就直接导致了特异荧光信号的衰减，无法捕获完整的体内真实信息。 3. 灵敏度较低：由于活体动物产生的自发荧光会影响到检测灵敏度，特别是当发光细胞位于组织内部，则需要较高能量的激发光源，与此同时也就会产生较强的背景噪音，导致检测灵敏度下降。,Licor 红外荧光技术的优点,* 极低的自发荧光干扰 动物的自发荧光皮

14、毛（黑色素）的发射光线波长峰值一般在500-520nm左右，血红蛋白的发射光线波长峰值一般在504-540nm左右，在大于600nm的近红外波段，活体内物质的自发荧光对于成像干扰小，背景噪音低，灵敏度高。 * 良好的组织渗透性 组织在可见光范围（350600 nm，脂肪 104: 8334 - 8339. Biomimetic amplification of nanoparticle homing to tumors PNAS, Jan 2007; 10.1073/pnas.0610298104. Re-introduction of C/EBP in leukemic CD34+ stem

15、/progenitor cells impairs self-renewal and partially restores myelopoiesis Blood, May 2007; 10.1182/blood-2006-10-052175. A Nuclear Function of b-Arrestin1 in GPCR Signaling: Regulation of Histone Acetylation and Gene Transcription Cell 2005 123： 833847 ATM Activation by DNA Double-Strand Breaks Thr

16、ough the Mre11-Rad50-Nbs1 Complex. Science 2005 308: 551-554,Odyssey 系统概况,全球装机超过4,000 systems，国内300套系统 4,060 publications,研究领域 Signal Transduction Apoptosis Protein Kinases Cell Biology Microbiology Virology,研究方法 Quantitative Westerns In-Cell Westerns On-Cell Westerns EMSA,总 结,准确定量提供更完善的数据，提升文章档次 成像

17、效果好背景低，条带清晰，没有吹泡现象 双色检测靶蛋白+总蛋白+Maker 同时检测 成本低无需底物，无需胶片，无需暗室，二抗稀释倍数高 扩展应用ICW，EMSA,小动物活体成像等,Thank you！,抗原,一抗结合,红外荧光标记的二抗,Infrared dye (IRD800, Alexa680),ODYSSEY成像原理,INFRARED LASER DIODE,INFRARED APD DETECTOR,红外荧光优点直接检测，操作简便,膜上抗原,一抗结合,红外标记的二抗,Odyssey直接扫描,不需要底物 不需要底片/暗室 信号持久,Odyssey双色同时检测,800 nm,700 nm,

18、Overlay,两套独立激发检测系统 700通道：680nm激发 720nm检测 800通道：780nm激发 820nm检测,应用二：双色ERK的磷酸化,Anti-ERK,Anti-phospho ERK,Results Overlaid,Non-Stimulated,EGF-Stimulated,Non-Stimulated,EGF-Stimulated,Non-Stimulated,EGF-Stimulated,700 nm channel,800 nm channel,700 and 800 nm,观察EGF刺激后A431细胞中ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases)的磷酸化情况, 一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用 抗兔的IRDye800 标记的抗体 (green),和抗鼠的 Alexa680 标记的抗体 (red) ERK:胞外信号调节激酶 EGF:表皮生长因子,EMSA的简介,EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。 该技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当