核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响 及机制（作者：单位：邮编：）作者：上官建营 窦科峰 李霄 胡小军，张福琴，雍召生， 遆振宇【摘要】 目的：探讨核心蛋白聚糖（decorin, DCN对HuH7细胞系体 外增殖的影响及机制。方法：加入不同浓度（0、25、50、75、100、 125、150、200卩g/L）的DCN培养HuH7细胞系不同时间（12、24、 48、72 h和2周）,用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT）法及克隆实 验测定细胞增殖速度和活力，流式细胞术测定细胞周期和凋亡情况。 结果:DCN浓度增加及作用时间延长，细胞增殖速度减慢、活力减 低，G1

2、期细胞增多，凋亡增加。结论：DCN可能为一种负性调控蛋白， 可通过调节细胞周期，抑制肝癌细胞的增殖，促进其凋亡。【关键词】 核心蛋白聚糖；HuH7;细胞周期；凋亡Abstract AIM: To inv estigate the effects and mecha nismof decorin（DCN） on the proliferationof HuH7 hepatomacarcinoma cell line in vitro. METHODSHepatomacarcinoma cells was cultured with DCN in different concentration (

3、0, 25, 50,75, 100, 125, 150, 200 卩 g/L) for different time(12, 24, 48,72 h and 2 weeks). Cell activities were studied by MTTand clone test. The changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by Flow cytometry. RESULTSThe proliferation of HuH7cells could be in hibited by DCNn vitro and the in hibi

4、ti oneffect was thetime and dose depe ndent relati on ship. DCN could block cell cycle at G1 phase. Apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficie ntly in duced by DCN in a time/dosejtidepe ndent manner.CONCLUSIONDCNmaybe a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell prolifer

5、ationthrough inhibitingcellcycle and in duc ing apoptosis of cell in vitro.Keywordsdecori n; HuH7; cell cycle; apoptosis核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家 族中的一员，主要由结缔组织产生，是一种多效性分子1。有许多 资料表明DCN是一种抗增殖因子，能够抑制多种细胞增殖，极可能 是一种肿瘤抑制物，使转化的细胞和肿瘤静止2,这提示DCN有可 能成为新的抗肿瘤药物。本实验旨在探讨DCN对人肝癌细胞生长的影 响及其作用机制，为肝癌的防治提供新的思

6、路。1材料和方法1.1材料 人类肝癌细胞HuH7细胞由本实验室提供。RPMI 1640 培养基购于Gibco公司，按说明以双蒸水溶解，滤膜过滤除菌，分 装，-20 C冻存备用。新生牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产 品，经56C 30 min水浴灭活后，-20 C冻存备用。96孔、6孔细胞 培养板为 Corning 拟Costar 公司产品。Recombinant Human Decorin（Catalog Number: 43拟DE）购自美国 RD公司，用 PBS稀释浓 度为 1 000 卩 g/L, -20 C冻存备用。HEPlass100 CO2孵箱为 Thermo 公司产品，CKX4

7、1荧光倒置显微镜为日本 Olympus公司产品，流式细 胞仪为Beckman Coulter公司产品。1.2方法1.2.1 细胞培养HuH7细胞培养于100 mL/L新生牛血清 RPMI1640培养液中，含105 U/L青霉素，100 mg/L链霉素，培养条 件为37C、50 mL/L CO2、饱和湿度。培养的细胞均为上皮样贴壁 生长，细胞密度（0.11） x 109/L,每34 d传代1次，取对数生长 期细胞用于实验。1.2.2细胞处理 取对数生长期细胞调整密度至1X 109/L,接种 于96孔板，100卩L/孑L。接种24 h后换液，分别加入含0、25、50、 75、100、150、200

8、卩g/L DCN的培养液，分别以PBS为空白对 照、不含DCN培养液为阴性对照，每孔设4个复孔，分别于12、24、 48、72 h用MTT法检测吸光度（A490值）,并绘制曲线。取对数生长 期细胞接种于6孔板，200个细胞/孔。接种24 h后换液，分别加入 含 0、25、50、75、100、125、150 卩 g/L DCN 的培养液，分 别以PBS为空白对照、 不含DCN培养液为阴性对照培养2周，当培 养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，甲醇固定，吉姆萨染色 后计克隆数，计算克隆率，并绘制曲线。123流式细胞术检测细胞周期和凋亡 收集对数期生长的HUH7 细胞,配成单细胞悬液（1 X 10

9、9/L）,与浓度为0、25、50、75、100、 150卩g/L的DCN共同孵育96 h, PBS清洗，标本用胰蛋白酶消化成 细胞悬液，其中一份标本用PBS洗涤2次并将细胞密度调整为109/L。 首先用微量移液枪移取20 L细胞悬液，然后细胞悬液中加入Annexin拟.V并避光静置15 min后，将PI染料加入并静置30 min,上 机检测。另一份标本加无水乙醇固定。PBS洗涤乙醇，取细胞悬液2 mL, 以1 500 r/min离心5 min,弃上清，轻轻摇动，加入PI去污染液（含 10 mL/L Trit on X拟100）2 mL,避光染色10 min。流式细胞仪检测,每 份标本测定20

10、000个细胞，测量速率为150200个细胞/s。用 MultiCycle for Win dows软件分析被采集资料。1.2.4统计学分析 数据用x 士 s表示，应用SPSS15.0软件包进 行统计分析，不同时间及浓度DCN对细胞增殖情况、细胞周期及凋 亡率影响的比较采用SNK；q检验,检验水准取a =0.05。2结果2.1 DCN不同浓度及时间对HuH7细胞增殖的影响HuH7细胞经 Dcr作用不同时间，其吸光度在同一时间点随作用浓度增加而逐渐降 低，说明细胞增殖随DCNt度增加而逐渐减弱；同一浓度DCN作用， 随着作用时间的延长，吸光度增加速度逐渐减慢，说明较对照组细 胞增殖活力减低（图1,

11、 P0.052.2 DCN作用浓度对HuH7细胞增殖的影响将不同浓度DCN乍用 HuH7细胞96 h后吸光度（A490值）结果做统计分析（表1）。显示不同 浓度DCNA值与阴性对照组比较差异有统计学意义 （P0.05或P0.01）, 表明不同浓度DCN对细胞增殖的影响不同，且随浓度增加，抑制效 果逐渐增强。2.3克隆实验结果HuH7细胞以不同浓度DCN培养2周， 出现肉眼可见克隆，处理后计数并计算克隆率（Clone Rate）, 结果 显示，随着DCN浓度增加，细胞克隆率呈下降趋势，这表明DCN对 HuH7增殖有一定抑制作用（图2）。表1不同浓度DCN乍用HuH7细胞 96 h A 值2.4

12、DCN寸HuH7细胞周期和凋亡率的影响 随着DCr浓度的增加， HuH7的 G1期细胞数明显增多，S期细胞数明显减少，G2期细胞数则 无明显变化规律，同时凋亡细胞率逐渐升高（图3、4）。3讨论DCN是在细胞外基质中存在的小分子蛋白聚糖，与肿瘤的发生、 发展密切相关。Santra等3将DCNCDNA急定转染人乳腺癌 MDA；453 细胞，这些被成功转染的细胞克隆表现明显的生长抑制，细胞克隆在软琼脂上不形成集落，在scid小鼠中不形成肿瘤，并且G1期细胞 增加。此外，Nash等4研究发现直接加入人DCN能够抑制卵巢癌细 胞系SKOV和2774细胞的增长，并且与抗肿瘤药物卡铂有协同作用。 Konin

13、ger等5研究发现直接加入人DCN能够抑制胰腺癌细胞系的增 殖，Tralh崔o等 进一步报道腺病毒介导的 DCN cDNA勺表达能够 使肿瘤细胞在小鼠体内凋亡并且可以抑制对侧肿瘤细胞的生长，而且这种抑制还是特异性的，正常组织细胞却不发生凋亡和生长抑制本研究显示DCN可抑制体外培养HuH7细胞增殖，流式细胞术检 测GO期细胞显著增多，G1期细胞周期阻滞，G0/G1期的肿瘤细胞比 率越高，表明DCN可以延缓肿瘤细胞由G1期向S期的过渡，使S期 和G2期细胞明显降低，提示DCN可能影响细胞周期细胞，使HuH7细 胞多数停滞于DNA合成前期，DNA合成障碍，使肿瘤细胞的倍增时间 延长7。同时本实验中经

14、DCN乍用后的HuH7细胞凋亡率显著地增高， 提示诱导凋亡亦可能是 DCN抑制肝癌细胞的机制之一。国内外有关 DCN文献报道其有效工作浓度基本上都是在mg/L水平，本实验将重组人DCN用 PBS稀释成1 000卩g/L, -20 C冻存备用。在预实验及 实验时均得出理想的结果，而且随剂量增大及时间的延长抑制效果 明显增加。在肝癌细胞体外培养小剂量DCN未见到刺激细胞增殖作用， 这可能早期国内报道 DCN对正常肝细胞及肝星形细胞有双重调节作 用不同，即0.01 mg/L DCN可刺激正常肝细胞及肝星形细胞的增殖； 5、10 mg/L DCN则具有抑制细胞生长的作用，这可能提示DCN在肝 癌中的作

15、用不同于正常肝细胞，小剂量DCN对肝癌细胞系HuH7即有 明显抑制效果可能也与其本身生长特性也有一定关系。国外报道DCN最高浓度用到500 mg/L,且发现增加到一定剂量后，细胞抑制效果 不再增加4。本实验所用小剂量有明显抑制作用，但由于剂量普遍 偏小，未发现抑制效应平台期，DCN对于肝癌细胞系进一步作用效果 有待于深入研究。目前对肝癌治疗尚没有理想的药物，DCN的发现为防治肝癌开辟 了新的途径。DCN是机体本身所有的细胞外基质的成份，从组织中提 取天然的DC有广泛的来源和技术上的可行性，基因克隆技术也已成 功获得DCN,使得DCN在肝癌的防治中具有良好的应用前景。我们观 察了不同浓度DCN乍

16、用不同时间对人肝癌细胞株 HuH7细胞体外生长 的影响，结果显示，DCN能够抑制HuH7细胞的体外增殖，抑制G1/S 期转换，抑制肿瘤细胞的生长，具有抗肿瘤作用和肿瘤组织的分化 调节作用，且这种增殖抑制和诱导凋亡作用呈剂量依赖性和时间依 赖性，随着DCN浓度的增加，作用逐渐呈上升趋势。这提示我们如果 DCr用于临床抗肝癌治疗时，必需有足够用药计量和用药时间，从而 维持有效浓度，才能更好的发挥抗肿瘤作用。【参考文献】1 Dodge GR, Diaz A, Sanz拟Rodriguez C, et al.Effects of i nterfero n扌!)；gamma and tumor n ec

17、rosis factor alphaon the expression of the genesencoding aggrecan, biglycan, and decori n core prote insin culturedhuma n cho ndrocytesJ.Arthritis Rheum, 1998, 41(2): 274-283.2 Reed CC, Gauldie J, Iozzo RV. Suppression of tumorige nicity by ade no virus 扌以 mediated gene tra nsfer of decori nJ. On co

18、ge ne, 2002, 21 (23): 3688-3695.3 Santra M, Skorski T, Calabretta B, et al. De novodecori n gene expressi on suppresses the malig nant phe no type in human colon cancer cellsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(15): 7016-7020.4 Nash MA, Loercher AE, Freedman RS. In vitro growth inhibition of ovarian cancer cells by decorin: synergism ofaction between decorin and carboplatinJ. Cancer Res, 1999,59: 6192-6196.5 Koninger J, Giese NA, diMol