细胞增殖凋亡粘附的测定方法

1、细胞增殖的检测方法：四甲基偶氮唑盐法(MTT)MTT商品名为噻唑蓝， 是一种黄色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色 法，用于检测细胞存活和增殖。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死 亡的细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析 仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测、肿瘤细胞的生长、生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以 及肿瘤放射敏感性测定4-8等

2、。此方法简便、灵敏且无放射性。MTT溶液需要放置在4C避光保存，最好是现用现配。由于 MTT经还原所 产生的产物甲瓒不溶于水，无法直接测定吸光度，需要被溶解之后才能检测。这 不仅使工作量增加，而且 MTT溶液具有致癌性。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞的绝对数。另外，有研究发 现过氧化物会降低MTT测定的准确度，抑制将近95%的MTT与O2 的反应， MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。内盐法(MTS)MTS是一种新型的MTT类似物。MTS在偶联剂PMS存在的条件下，可 被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，

3、其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。它的优点在于无放射性、 快速、安全、方便、灵活及特异性强，同时又克服了 MTT、XTT的缺点。此方 法已应用于细胞增殖的检测、药物敏感性试验、细胞毒性的检测等，且比MTT法更加准确。此方法在一定程度上也存在缺陷。最新研究表明在96孔板试验中，靠外的 孔液体易蒸发，对检测结果有一定影响24，且不适合于猪淋巴细胞促有丝分裂 反应的检测.细胞粘附能力测定：蛋白染料染色法测细胞粘附本法是以蛋白染色剂如氨基黑10B来问接测定96孔板中的细胞数目，该法迅速可 靠，还可用怍细胞形态学观察和染色细胞的照像。Schulz等对入角化细胞株HaCaT受其

4、亚克隆细胞株、鼠成纤维细胞林 3T,骨髓瘤细胞株x63Ag8. 653 作过这方面的研究。即用甲醛或戊二醛固定粘附细胞，吹打去除未牯附的细胞 而 粘附的细胞用pH3, 5的氨基黑染色，先用pH3. 55的盐酸洗去附着的染料，结 合的蛋白染料可用NaOH溶解，然后在酶标仪上读取620rim/405或750rim处的 0D值。若用该法反映未牯附和半粘附的细胞数量，可在染色前先离心t然后固定。 该法测量表明，氨基黑的染色吸光度值与细胞数、DNA含量呈良好的线性关系，直线的回归斜率对不同的细胞而有所不同。另外、该法可用来测定某些药物的细胞毒作用、LAK细胞的杀伤作用以及杂交瘤抗体对细胞扩增的生物效应。

5、E rtt曾用氟基黑染色法来问接反映24孔板上培养的细胞数，但其操作过程比较繁琐， 如细胞固定，染色细胞蛋白质沉淀，多次温育、冲洗、离心、溶解变性强白，最 后转移至比色杯中进行常规比色。 而本法只需在96孔板上即可进行。实验结果重 复性好，敏感性高，时间短，试剂便宜。但在测定某种细胞的粘附性时，必须先 建立其细胞数与光密度值之问的回归曲线。因为某一特定细胞的直线回归斜率与该种细胞的太小及其蛋白质的含量有关。 氨基黑染色法不能区分死亡细胞与活的 细胞，但是粘附生长的细胞一旦死亡。即可自行脱离吸附的介质，被吸出洗去。 因此，需要用cr标记和其他物质拆记靶细胞测定粘附的试验太多可用该法代替。 值得注

6、意的是，死亡后仍能附着的细胞不能用氨基黑染色法测定粘附性这时可以选用中性红、MTT以及其他台适的染色方法。Joni曾用氨基黑染色法测定细 胞弱粘附特性 -即最小切应力粘附 测定(MinimaSheariorce adhesion assay, MSFA)，其步骤与常规的粘附测定方法基本一致。不同之处是去除未粘附细胞时， 在液体中用轻柔的切应力去除未粘附的细胞，这样强粘附与弱粘附的细胞可同时 被测定。MSFA法去除非粘附细胞的操作方法如下：将孵育后台粘附细胞的96孔板扳孔朝上以一定角度浸入盛有0，85 Nacl盐液的容器中(容器中含液量约为2.5 升)然后在液体中轻轻反转培养板避免板孔中形成气泡

7、，使板孔向下板底向上， 这时可使培养板从液体中升至液面，容器中的盐液用40ram长的转子.以300rPm 的转速室温下搅动7分钟这样板孔中未桔附的细胞可技去际96孔板从NaC盐液容器中取出时，要重新翻转板孔向上，然后浸入含100甲醇的容器中，在甲醇 溶液中上下左右转动96孔板使盐波和甲醇充分混台.切勿使细胞暴露于空气中， 每过5分钟重复以上动作，60分钟后从甲醇液体中取出96孔板一去掉甲醇，染色 细胞，酶标仪上读取570nm OD值一牯附率的计算用以下公式：OD570粘附细胞粘附率 =X100%OD570孔中加入的总细胞用该法测得的牯附率高于常规方法的2. 5-3倍，而基础的非特异性粘附率不变

8、。 结晶紫染色：他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、 纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时， 用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色， 纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片， 缺点是不易长久保存。苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，易溶于热水 和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。它是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。 分化时组织所染的颜色因处理的情况而异， 用酸性溶液（如盐酸一酒精）分化后呈红色

9、，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。遇光变红。Giemsa染色法：嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与 酸性染料伊红 结果，染粉红色， 称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与 碱性染料美蓝或天青 结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与 伊红和美蓝均可结合， 染淡紫色，称为中性物质。 m#UOkrOPH对细胞染色有影响。细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质， 所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下正电荷增多，易与伊红结合，染色 偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正

10、经片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞特 液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各 种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。MTT（I）接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培 养液配制成单个细胞悬液，以每孔103104个细胞接种于孔板中（本实验所接种 的细胞数是每孔2x103个细胞）,每孔体积200ul,各组每个时相6孔,测量时取6孔OD 平均值。同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔。 （2）培养细胞：将培养板放入 COZ孵箱,在37C、5%COZ及饱和湿度条件下培养（培养时间取决于实验目的和要 求)。(3)呈色:分别于1

11、天、2天、3天、4天和5天,在待测孔中每孔加入 MTT溶液 (smg/ml)20ul,37C继续孵育4一6h,终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入 150ulDMSO,振荡10mi n,使其充分溶解。(4)比色:选择490nm波长,在酶联免疫检测 仪上测定各孔光吸收值(OD值),一记录结果。以培养时间为横轴，光吸收值为纵 轴绘制细胞生长曲线。2.1细胞培养2.1.1细胞的复苏(l) 细胞培养室的常规消毒无菌操作配置好IOml完全细胞培养液并放入37C恒温水浴箱中预温至37C并 转入无菌细胞培养瓶内备用。从液氮中待复苏的细胞，立即放入37C很稳水浴箱中轻轻来回旋转，确保细胞 冻存液在1分值

12、之内解冻。待细胞解冻，立即用滴管吸取解冻的细胞悬液放入装有预温的完全细胞培养液的细胞培养瓶内，置37C、5%C02恒温恒湿细胞培养箱中培养，次日换液。2.1.2培养细胞换液(1) 细胞培养室的常规消毒。(2) 按常规操作配制好完全细胞培养液并放入 37 C恒温水浴箱中预温备用。(3) 从细胞培养箱中取出前一日复苏的装有细胞的细胞培养瓶，置倒置显微镜下观察细胞生长情况。(4) 在无菌操作台内用直头吸管轻轻吸出旧的培养液至废液缸，弃吸管。(5) 取新吸管,加入无血清的不完全培养液，轻轻转动培养瓶，把残存的旧培养液冲 掉。(6) 弃去无血清的不完全培养液，加入事先已预温的完全细胞培养液。(7) 盖好

13、培养瓶的瓶盖(稍松)，置37C、5%C02恒温培养箱继续培养。(8) 清走所有吸管、玻璃用品等，擦拭工作台。2.1.3细胞的冻存(1) 细胞培养室的常规消毒。(2) 按常规操作无菌配制好1.Oml细胞冻存液。(3) 从细胞培养箱中取出装有细胞的细胞培养瓶，拧紧瓶盖,置倒置显微镜下观察细胞生长情况。当细胞处于对数生长期时(长满细胞培养瓶底部70一80%面积时), 此时即可冻存。(4) 冻存细胞24小时前给细胞换液。用胰酶消化收集细胞，重悬在含有完全培养基中，1000印n订min离心5分全中。 去除胰酶及旧的培养液，留细胞沉渣。加入预先配制好的细胞冻存液(含无血清 的不完全培养液7份，纯血清2份,

14、DMS01份)。(7) 用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装入无菌冻存管中，每只冻存管内加液Iml。旋紧 冻存管瓶盖，做好标记,用封口膜封住冻存管瓶身及瓶盖。(8) 将装有细胞的冻存管依次 4C 60分钟一一 20E 60分钟一一 80C过夜一液氮内 长期冻存。2.1.4细胞的传代(1) 吸除或倒掉培养瓶内旧培养液。(2) 用无血清的培养液洗细胞1次。(3) 向瓶内加入Iml胰蛋白酶消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面, 然后吸掉或倒掉消化液后再加Iml新的消化液,轻轻摇动后再倒掉大部分消化液, 仅留少许进行消化。或者不采用上述步骤，直接加1 一Zml消化液进行消化，但要注 意尽量减少消

15、化液的剩余量。(4) 在37C或室温25C以上环境进行消化，消化2一5分钟后把培养瓶放置于倒置显 微镜下进行观察，发现细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化。(5) 小心倒掉残余消化液(不含EDTA)或直接加入含血清的培养液，终止消化。(6) 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养 瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔，不 要用力过猛，同时尽可能不要出现泡沫，以免对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成 细胞悬液。流式细胞仪检测细胞凋亡基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变t 2些改变包括细

16、胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几丨方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各 彳染色体荧光染料对凋 亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋 亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许学者把这种DNA可染性的降低认门 是凋亡细胞的标志之 。2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细 胞仪上，散射光与细胞的片小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作 用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射 光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的

17、特点之一。 此外细胞凋亡时由于染色 体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞 坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此 可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前 散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性 较好，而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最 主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

18、试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS (pH7.4)中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4C 避光保存。70%乙醇400 目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞数目约（1 5） X106个/mL, 500 1000 r/min 离心5min，弃 去培养液。2. 3ml PBS 洗涤 1 次。3. 离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定，4C, 1 2小时。4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。5. 400目的筛网过滤1次，500 1000r/min离心5min，弃去PBS。6. 用1ml PI染液染色，4C避光30min。7. 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光,

19、激光光波波长为488nm，发射 光波波长大于630nm,产生红色荧光分析 PI荧光强度的直方图也可分析前散射 光对侧散射光的散点图。8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正 常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析 PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞 碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在 G1/G0期前出现一亚 二倍体峰。如以 G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞 样本其亚二倍体峰的 荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别 为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。注意事项细胞凋亡时，其 DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种 DNA可染性降低也可能是因为 DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变 使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。流式检测细胞周期要点：最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！1、细胞消化要理想，资料显示