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1、 毕 业 设 计(综 述) the review of the interaction of nano materials and cells纳米材料与细胞作用的研究综述 申请学位: 学士学位 院 系: 药学院 姓 名: 孟凡飞 学 号: 122120209 指导老师: 张怀斌(讲师) 二0一四年六月十二日目录摘要.1abstract.2 引言.31纳米zno的制备及性质.31.1 纳米zno的制备.31.1.1 制备方法的概述.31.1.2 醋酸锌法制备纳米zno.3 1.2 纳米zno的性质.52纳米zno与不同细胞的相互作用.52.1 纳米zno与人支气管上皮细胞(beas-2b).52

2、.2 纳米zno黄曲霉细胞的相互作用.62.3 对白色念珠菌的生物毒性.62.4 纳米zno对人胚肺成纤维细胞(helf)的生物毒性的剂量效应.72.5 尺寸效应对zno纳米粒子对洋葱表皮细胞作用的影响.83展 望.93.1 发展与应用.93.2 缺点与改进.10参考文献.11致谢.13 纳米材料与细胞作用的研究综述孟凡飞摘要: 从近年来对于纳米材料的安全性评价的工作进展看,人们对于现今应用较广的zno纳米材料的生物安全性研究较少。本文将着重阐述zno纳米材料在机理、剂量、尺寸方面对不同生物细胞的相互作用,为做好纳米材料使用的安全防护工作、研究纳米材料在生物安全性方面的影响、建立一套研究纳米材

3、料安全性评价的方法提供必要依据。关键词: zno纳米材料;机理;剂量;尺寸;生物细胞;相互作用 the review of the interaction of nano materials and cellsmeng fan-feiabstract:from the recent progress about the safety evaluation of nano materials,the research on biological safety of zno nano materials that are widely used today is very less. this p

4、aper will focuse on the interaction of different biological cells and zno nano particles in mechanism, dose and size,to do a good job about security protection of nano materials used, research the effects of nano materials in the biological safety, provide the necessary basis for the establishment o

5、f a set of research method on safety evaluation of nano materials.keywords:zno nano materials;mechanism;dose;size;biological cells;interaction 引言 纳米材料是指至少在一维空间上粒径不大于100nm的材料,主要有四大类:纳米粉末,如纳米zno粉末;纳米纤维,如碳纳米管;纳米膜,如纳虑膜;纳米块如zro2和tio2纳米块体。由于其尺寸很小,结构特殊,因此具有许多新的物理化学特性,如尺寸效应、大的比表面、极高的反应活性、量子效应等1。随着纳米技术的产业化,各

6、种纳米材料因其优良特性及新奇功能而具有广泛的应用前景,遍及工业、农业、制造业、军事、医疗等诸多领域2。而日常的生活用品中,如化妆品、食品、织物、涂料、抗菌材料等,也含有纳米材料,人们接触纳米材料的机会同益增多3。由此,纳米材料的生物效应和安全性问题也凸显出来,尤其是纳米颗粒对人体健康、生存环境和社会安全等方面是否存在潜在的负面影响。毒理学研究结果表明纳米颗粒可以以各种途径进入人体或生物体,包括吸入、摄食吸收、皮肤渗透等,随后在生物体内产生不同水平的毒理学效应4。 目前体内外的实验证实纳米zno可在不同程度上对细菌、水生生态动物、哺乳动物细胞产生毒性作用,对多种正常或不正常细胞产生相互作用5。1

7、 纳米zno的制备及性质1.1 纳米zno的制备1.1.1 制备方法的概述 目前实验室制备的方法主要有以下几种:(1) 醋酸锌法 以znac22h2o为原料,经溶解,加热回流,沉淀,洗涤,离心,干燥得本品。然后表征,经sem(扫描电子显微镜)测试,x射线衍射,hrtem(高分辨率的透射电镜)测试得本品。这也是主要的制备方法。(2)氢氧化锌法 利用硝酸锌制得前驱氢氧化锌,在600保持2h,高温热分解得纳米氧化锌。 (3)直接沉淀法 在可溶性锌盐中加入沉淀剂后,当溶液离子的溶度积超过沉淀化合物的溶度积时,即有沉淀从溶液中析出。沉淀经热解得纳米氧化锌。常见的沉淀剂为氨水、碳酸铵、和草酸铵。此法操作简

8、单易行,对设备要求不高,成本较低,但粒度分布较宽,分散性差,洗涤原溶液中阴离子较困难。1.1.2醋酸锌法制备纳米zno 将适量znac22h2o称量后加入到三口烧瓶中,用量筒量取一定体积的xylene溶剂,加入三口烧瓶,搅拌溶解。随后称取dbs加入到上述的体系并加入一定的量50n2h4h2o的乙醇溶液。反应在室温条件下进行。在滴加的初期,微混的微乳液会逐渐澄清,但是随着滴加过程的进行,开始出现白色沉淀,直到反应结束,沉淀始终存在。在滴加完毕后,继续搅伴14小时以上,然后加热回流。回流完毕后,在离心作用下将固体沉淀从溶液中分离出来。将沉淀用特定的溶剂洗涤,以除去多余的杂质,经过多次的洗涤、离心后

9、,将沉淀在低温的真空条件下进行干燥或者自然干燥,得到干爽的粉末,粉末可以用来测试结构和性能。更换溶剂和表面活性剂得到其他形貌的产物。在实验中,对样品进行了表征,方法如下所示:(1)sem测试所用的仪器型号是jeol s4800,加速电压5kv。样品 制备:将一小片5wanx5minx2mm的玻璃片在醇中超声清洗并干燥后,将待粉测末样品在乙醇中超声分散后,滴在干净的玻璃片上,在室温下晾干后进行喷金处理,处理完毕后可以进行测试。(2)x射线射实验所用的仪器是日本生产的衍射仪(rigaku,dmax2cu-ka),所用波长为1.5406,工作电压为40kv,电流为30ma,扫描速度为00100/s。

10、样品是粉末态,装在一个有凹糟的平面玻璃板上,压平后进行测试。(3)hrtem测试在jem2100f型高分辨透射电镜上进行。jem高分辨透射电镜的相关参数为:加速电压,200kv;晶格分辨率,0.14nm;分辨0.23nm;放大倍数2000-1500000。配有x射线能谱仪和多扫描ccd相机6。扫描图像如下图1. 图1. 纳米zno的形貌,a and b sem,c和d为b中纳米棒hrtem图像1.2纳米zno的性质 与常规氧化锌相比,纳米氧化锌对生物细胞具有较强的氧化性、光催化氧化性,与大分子共价结合效应,尺寸效应7,浓度效应等,性质的不同,直接导致其对生物细胞有着不同的影响作用。对其上述性质

11、的研究,安全使用,仍是当今纳米技术研究的重要课题。 此外,纳米级氧化锌还是一种新型锌源8,具有较高的生物活性、免疫调节能力和吸收率,较少的纳米氧化锌即可达到促进生物体生长的功效9。2 纳米zno与不同细胞的相互作用2.1纳米zno与人支气管上皮细胞(beas-2b)之间的相互作用 huang10等对人支气管上皮细胞(beas-2b)细胞进行zno纳米粒子(20nm)悬液染毒。研究表明,纳米氧化锌对 beas-2b 的毒性,是通过乳酸脱氢酶(ldh)、活性氧(ro)测定结果推测氧化应激可能是纳米粒子产生细胞毒性的机制之一,对相关基因进行检测,发现 bnip,prdx3,prnp 和 txrnd1

12、 基因表达异常,说明纳米氧化锌改变了beas-2b 细胞转录调控,dna合成受损,导致细胞死亡。这与 heng11的研究结果不谋而合。机理如下图2. 图2. 纳米zno颗粒引起氧化损伤并导致dna损伤的毒性机理示意图2.2纳米zno黄曲霉细胞的相互作用 纳米zno缓释出的zn+接触微生物,因细胞膜带负电荷而与zn+发生库伦吸引而相互接触,即所谓的微动力效应,导致zn+穿透细胞膜进入微生物体内,与微生物体内的蛋白质上的硫基发生反应使微生物蛋白质结构破坏,造成微生物死亡或者产生功能障碍。从而将黄曲霉细胞杀死12。机理如下图3. (蛋白质)-sh+zn+ (蛋白质) szn+h+ (蛋白质、核酸)-

13、h+zn+ (蛋白质、核酸)-zn+h+图3. 纳米zno杀灭黄曲霉细胞的作用机理2.3对白色念珠菌的生物毒性 到目前为止,由于纳米zno的抗菌性能以及它作为一些传染病的抗菌药,存在潜在的药用价值,许多已经发表的论文中研究了纳米粒子对于微生物的影响。例如,adams等13,brayner等14,以及zhang l15等人的研究都表明纳米zno粒子对于e. col菌的生长有明显的抑制作用。roselli等人的研究也表明,zno可以通过抑制损伤肠细胞的e.coli菌而保护肠细胞16,huang z等人的研究中发现zno对于可以导致人类传染疾病的链球菌和葡萄状球菌有很好的抑制作用17。特别是在光催化

14、对白色念珠菌等细菌的杀灭抑制作用18。 纳米氧化锌光催化杀菌剂,通常表现出超过传统抗菌剂(即仅能杀灭细菌本身)的性能。对于纳米半导体,当粒子细化到纳米尺度时,产生电子和空穴的氧化还原能力增强19。受阳光和紫外线的照射时,纳米氧化锌抗菌剂在有水分和空气存在的体系中能自行分解并释放出自由电子(e.),同时留下带正电的空穴(h+),生成的带羟基的自由基oh和超氧化物阴离子自由基o2都非常活泼,化学活泼性很强,能与多种有机物发生反应(包括细菌内的有机物及其分泌的毒素)从而将微生物杀灭20。纳米氧化锌在阳光尤其是紫外线照射下,具有极强的化学活性,能与大多数有机物(包括细菌) 发生氧化反应,从而杀死大多数

15、病菌和病毒21。据此,可以对某些癌细胞进行光动力杀灭,传统的光敏分子治疗方法相比,避免了光敏分子容易发生脱落现象,相关工作还在进一步研究当中22。作用机理如下图4. 图4. 光激发zno杀菌机理 2.4 纳米zno对人胚肺成纤维细胞(helf)的生物毒性的剂量效应 以细胞生存率为纵坐标,对zno 纳米粒子浓度(横坐标)作图,结果如图5.所示 图中可见,helf细胞与不同浓度的40nm 氧化锌纳米粒子相互作用72小时后细胞生存率与纳米氧化锌浓度的增大而急剧减小23。当zno 纳米粒子浓度低于2.45mg/l时,细胞几乎没有明显变化,而当浓度达到约20mg/l时,细胞存活率已低于10.这表明细胞的

16、生存率受纳米氧化锌浓度影响非常明显。实验过程发现, 纳米氧化锌浓度超过40mg/l后,溶液已出现明显浑浊,影响了光线透光率,导致吸光度失真增大。所以,图中显示细胞生存率下降趋势平缓.正如文献报道24,在较低浓度时,氧化锌纳米粒子的生物安全性是也可靠的.本实验中浓高于20mg/l 时,人胚肺成纤维细胞死亡率显著增加25。 图5. helf细胞与不同浓度40nm氧化锌纳米粒子作用后的存活率2.5 zno纳米粒子的尺寸效应对洋葱表皮细胞作用的影响 宁月辉研究了zno纳米粒子和zno纳米棒对洋葱表皮细胞的影响。结果表明:粒径较小(5 nm)的zno纳米粒子能够透过细胞壁而进入细胞内部,并且富集在细胞核

17、上。尺寸较大的zno纳米棒则无法穿越细胞壁。由此可知纳米材料的尺寸和形貌是影响其生物效应的重要因素26。 通过荧光显微技术证实了直径5 nm左右的纳米氧化锌粒子能够穿透洋葱表皮的细胞壁和细胞膜,进入细胞内部,并富集在细胞核上,引起细胞紫外区发光特性的改变。纳米材料在生物体内可以穿过其他材料难以穿越的部位,因此纳米材料在生物体内可能会出现特殊的代谢情况,并且可能会与某些特定部位的器官或者组织细胞作用进而带来某些特殊毒性,所以富集在细胞核上的氧化锌纳米粒子对生物的生长与发育可能存在不利影响。直径约为200 nm的氧化锌纳米棒由于其尺寸较大,难以穿过洋葱表皮细胞的细胞壁和细胞膜进入细胞内部,在细胞的

18、荧光显微照片上,没有观察到来自细胞核周围的绿色荧光。这说明氧化锌纳米材料对细胞壁的穿透能力与其形貌和尺寸有密切关系。当我们讨论纳米物质的生物效应或毒性这个问题时,不能泛泛而言,必须明确材料的种类、形态、尺寸(粒径)大小、以及剂量的多少等参数,即使同一种类的纳米材料,当其尺寸(粒径)大小不同,其生物效应可能相差很大27。如下图6. 图6. zno纳米粒子(a)和zno纳米棒(b)处理的洋葱表皮细胞3 展 望3.1 发展与应用 纳米技术自20世纪问世以来,纳米材料在全世界大量涌现28,越来越多的纳米材料应用于人们的日常生活,其中,纳米zno以其独特的性质成为近年纳米复合材料的研究热点,在人类社会中

19、被广泛应用,包括防晒剂,食品添加剂,传感器,电子材料等等。近年国内功能型纳米复合材料的应用研究十分活跃,已有商品化产品问世,且已有较多的纳米粉体生产企业,可生产各种各样的用于制备纳米复合材料的粉体材料29。纳米zno在生物医学方面的应用如:癌症的治疗、细胞内部染色、纳米药物控释材料、纳米抗菌材料、创伤敷料、生物活性材料等,也将会有更大的发展利用空间。3.2 缺点与改进 其所引起的安全性问题也必须给予足够的重视。活性氧的产生和纳米粒子的细胞内化是纳米粒子与细胞相互作用过程中的两个普遍现象。纳米粒子的生物毒性主要是由其内核的结构所决定,表面修饰对纳米材料的毒性也起到相当重要的作用。对那些在生物应用

20、研究中有重要应用的纳米粒子,表面修饰的类型是必须考虑的因素。对毒性有影响的因素还有表面电荷,阳离子毒性比阴离子毒性更强一些,中性表面纳米粒子具有最强的生物相容性。究其原因可能是阳性粒子比较容易接近带负电的细胞膜30。2003年的美国化学会年会上报告了纳米颗粒对生物可能的危害。2003年4月science31、2003年7月nature32相继发表编者文章,开始讨论纳米尺度物质的以及对环境和健康的影响问题。2004年1月美国化学会的enviromental science & technologies33杂志、2004年6月science34再次载文强调,必须对纳米技术的安全性问题进行研究。英国

21、皇家学会和皇家工程院于2004年7月29日发布长达95页的报告,建议英国政府成立“纳米物质生物环境效应”研究中心,以期对纳米材料的安全使用,提供更多的依据,造福人类。参考文献1 roc mc. nanotechnology: convergenc with moden biology and medicinej. curr opin biotechnol, 2003, 14(6): 337-346.2 freitas ra. what is nanomedicine? j. nanomedicine. 2005.1: 2-9.3 aitken rj, chaudhry mq, boxall a

22、ba.manufacture and use ofnanomaterials: current status in the uk and global trends j. occup med. 2006. 56(5): 300-306.4 brody al. nano and food packaging technologies convergej. food technol, 2006. 60: 92-94.5 赵景霞. 纳米氧化锌对海马神经元电生理特性的影响及对pci2细胞生物学效应的机制研究d. 天津: 南开大学研究生院, 2010: 4-6.6 王龙. 几种纳米材料的制备及其安全性评

23、价d. 四川: 四川大学研究生院, 2007: 28-30.7 hoet hm, irene bh, oleg vs.nanoparticles-know and unknow herlth riskj. nanobiotechnology, 2004, 2(12): 1-15.8 高战军,顾有松,张跃. 高压下zno纳米线的结构相变和能带的尺寸效应d. 北京: 北京科技大学, 2008: 224-226.9 huang cc, aronstam rs, chen dr, etal. oxidative stress, calcium homeostasis,and altered gene

24、expression in human lung epithelial cells exposed to znonanoparticles j. toxicology in vitro, 2010, 24(1): 44-45.10 heng bc, zhao xx, xiong sj, etal. toxicity of zinc oxide (zno) nanoparticleson human bronchial epithelial cells (beas-2b) is accentuated by oxidative stressj. food and chemical toxicol

25、ogy, 2010, 48(6): 1762-1766.11 陈潇婷. 纳米氧化锌对人肝肾细胞的毒性作用研究d. 浙江: 中国计量学院研究院, 2012: 3-6.12 林璋. 纳米氧化锌及其复合体的防霉和霉菌毒素吸收研究d. 福建: 厦门大学, 2009:42-43.13 campbella, oidham m, becaira a , eta1particulate matter in polluted air may increase biomarkcrs of inflammation in mouse brainj. neurotoxicolog, 2005, 26: 133-140

26、.14 adams lk , lyon d yand alvarez p j jcomparative cootoxicity of nanoscale ti02, si02, and zno water suspensionsj. water res, 2006, 40(9): 35-45.15 braynerr, ferrari-iliou r, brivois n,djediat s, benedetti m fand fievet f. toxicologicalimpact studies based on escherichia coli bacteria in ultrafine

27、 zno nanoparticles colloidal mediumj. nano lett. 2006, 6(6): 866-870.16 zhang l, jiang y, ding y. investigation into the antibacterial bchaviour of suspensions of zno nanoparticles (zno nanofluids)j. nanopartres2007, 9, 479-48917 roselli m, finamorea.garaguso, i.britti m sand mengheri e.zinc oxide p

28、rotects cultured enterocytes from the damage induced by escherichia colij. jnutr, 2003, 133: 4077-4082.18 huang z, zheng x, yan d. yin g.liao x, kang y,yao y.huang d and haobj. langmuir. 2008, 24: 4140-4165.19 栾启夏. 纳米氧化锌对神经干细胞的作用机制研究d. 上海: 上海大学, 2009: 6-9.20 何临海, 孟松, 柳苗苗等. 纳米氧化锌对白色念珠菌的抗菌作用j. 中国组织工程研究, 2012, 16(25): 4599-4566.21 li yf, li m. juhewu yu zhuji j. 2008. 13(5): 1-5. 22 李玉芳, 李明. .新型抗菌剂-纳米氧化锌的生产和应用进展j. 聚合物与助剂, 2008, 13(5): 1-5. 23 yang fx, liu ql. anhui huagongj. 2006; 32(1): 11

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