如何选择缓冲液

1、几乎所有的生化实验都必须用到缓冲液，这是因为我们所处理的材料，生物分子或细胞胞器，在自然的环境中都受到严格恒定的pH控制，因此当我们将这些生物巨分子抽提岀来后若能将之保存于正常生理pH68的条件下，可使这些材料维持最佳稳定性。此外有许多的酵素反应都涉及H+的释放，若无缓冲液维PhosphatePhosphate-1I I I I I567 S 9Phosphate*I I I10 11 12图4生化实验常崩缓冲薇及其缓冲区间心持恒定的酸碱度，许多生化反应将无法顺利进行。虽然大部分的生化实验所需的环境在pH 68之间，但是仍有少数状况需要极端的pH环境，图4-1列出了在生化实验常用的缓冲液及其适

2、用之pH。以下我们将介绍一些生化实验常用的缓冲溶液。4.1.3 Phosphate buffers磷酸是最常使用的缓冲溶液之一，在pH 6.57.5之间具有很好的缓冲能力，加上磷酸本身就是细胞及许多生物液的成分之一，因此更能提供一种较天然”的环境。使用磷酸钠或磷酸钾都具有很高的溶解度，十分容易配制。但磷酸缓冲液有以下缺点： （1）会与一些有生物活性的离子如钙离子、镁离子产生沈淀（2）对高等动物细胞有少许毒性（3）会抑制部分生物反应。4.1.4 Tris bufferTris tris （hydroxymethyl） aminomethane 可算是生化实验中最常使用的缓冲液，尤其在分子生物实验

3、中最常使用。因为它有极佳的缓冲能力、毒性低、对生物反应的干扰极低，而且纯度很高。Tris本身是一级胺但是它并不会沈淀钙离子， 其pKa为8因此在pH 7.58.5有良好的缓冲能力，然而在pH 7.0时通常只能 配成低浓度（0.01 M）此时的缓冲效果就不怎么理想了！Tris缓冲液具有以下的缺点：（1）浓度会影响其pH，通常每稀释10倍，pH会下降0.1 pH unit （2）会干扰某些pH电极（3） pH受温度影响甚大，在摄氏255C 间每下降1C，pH下降0.03 pH unit。因此改进的方式包括了：稀释后重新校正其pH值使用特殊不受 Tris 干扰的电极 (3) 在所欲使用的温度下调配所

4、需的缓冲液。4.1.5 Carboxylic Acid Buffers这类缓冲液包括了醋酸盐(acetate)甲酸盐(formate)、柠檬酸盐(citrate)以及琥珀酸盐 (succinate)等等，这类缓冲液提供了 pH 36 异于一般缓冲液的缓冲区间，但由于它们都是天然代谢产物，因此有可能会干 扰某些生物反应。此外 citrate 与 succinate 也会与一些具生物活性的金属离子 (Fe3+, Zn 2+, Mg2+, etc.) 结合，产生沈淀。其中醋酸与甲酸都具有挥发性，在应用上可直接以真空干燥的方法去除。4.1.6 Borate Buffer and Glycine Buf

5、ferborate buffer 的缓冲区间在 pH 8.79.7 ， glycine buffer 则为 pH 9.510.1 都属于较碱性的缓冲液。较值得 注意的是某些噬菌体 (bacteriophage) 能稳定保存在 borate buffer 中。而 glycine 本身是代谢产物，有可能 会干扰部分生物反应，另外，两者都不具有 UV 吸收能力，且不与二价正离子作用。4.1.7 Good s buffer (Zwitterionic Buffers)在 1960 年代中期 Norman Good 鉴于一般的缓冲液系统并不适合生化实验所使用，因此研究了许多合成的 zwitterioni

6、c buffer ，找到许多适合生化实验的缓冲液系统，它们都具有以下特质：1. pKa 在 68 之间。2. 在水溶液中有高溶解度。3. salt effect 很小。4. 不易被运送通过细胞膜。5. 不易受温度、离子组成、浓度等因素影响解离度。6. 不会与金属离子形成错合物，或错合物不沈淀、不干扰生物活性。7. 化学性质稳定。8. 高纯度。表 4-1 列出了常用的 Goods buffer 及其特性。部分 buffer 如 Tris、 HEPES 和 PIPES 在不同的反应条件 下可能会有 free radical 产生，因此若对氧化还原敏感的实验要选择不会产生自由基的MES 或 MOPS

7、 。Good s buffers实在可称得上是 good buffer 了，但它唯一的缺点就是，贵！表 4-1 ：Goods buffers 及其缓冲区间pKa Useful pH(20 C) Buffer range6.15 MES 5.8 6.56.62 ADA 6.2 7.26.80 PIPES 6.4 7.26.88 ACES 6.4 7.47.15 BES 6.6 7.67.20 MOPS 6.5 7.97.50 TES 7.0 8.07.55 HEPES 7.0 8.08.00 EPPS 7.6 8.68.15 Tricine 7.6 8.88.35 Bicine 7.8 8.89

8、.55 CHES 9.010.110.40 CAPS 9.711.1 4.2 酸碱度计的原理与应用一般实验时 pH 值的计算通常是将玻璃电极浸入溶液中，再由酸碱度计的主机面板上读取数值。而在每一 次的测定时均需要两种电极，一个是用以感知氢离子浓度的电极(pH-dependent)，另一个适用以当参考的氯化亚汞电极(pH-independent)，此二电极在溶液中的电位差可由下列方程式(4-5)以电压来计算：V 为电极电压差Econstant 为参考电极 (氯化亚汞电极 )电位R 为气体常数 T 为绝对温度 F 为法拉第常数酸碱度计在使用前必须先校正。由方程式 4-5 可知电压 (V) 与温度

9、(T) 相关，因此酸碱度计也必须有温 度校正。在旧型的酸碱度计上会有一旋钮用来让用户调整待测液温度，但是新型的酸碱度计则能根据温度 自动更正 pH 值。现在最常用的酸碱电极是单一的结合电极 (combination electrode) (图4-2)，也就是氢离子浓度电极与氯化亚 汞参考电极被包含在同一玻璃管中。虽然此类电极一般价格均高过传统的双电极(dual electrodes)，但其在使用上较为方便。然而在使用该种单一电极时有一些准则必须遵守：当酸碱度计不使用时必须确定其是 在” standby ”的状态。在使用电极前必须检查氯化钾溶液的液面高度，如果太低则按照手册指示适量补充。调整温度

10、校正钮至操作温度，并确定功能指示光标是位于 pH 位置。然后将电极自储存液中取出，用水瓶 以蒸馏水润湿并用拭镜纸轻轻擦拭且吸干多余水分。然后将电极浸入校正液中，通常校正液为准确度在 0.02单位之pH 4，7和10的缓冲液。而校正用校正液的选择最好是能落在待测溶液2个pH单位内为主。此外电极使用时待测溶液要完全盖过电极前端之玻璃小圆球。将酸碱度计设定至”校正(calibration) 位置”，直到此一校正液正确读值被显示在面板上。将酸碱度计设定在”standby 的”状态，取出电极并清洗擦干后再放入另一不同pH 之校正液中重新测定读值。此时面板读值应落于此一校正液0.05 pH 单位内。如果没

11、有，则要重新校正或请厂商维修。校正完毕后，同样清洗并轻轻擦干电 极，而后将其浸入待测溶液中并记录面板 pH 读值。由于酸碱度计为一精密之设备，因此主机与电极均需适当而小心的维护。平时玻璃电极需保持清洁并浸泡 在 3M 氯化钾溶液中。待要使用时以蒸馏水润湿并轻轻擦干即可。由于玻璃电极昂贵且易碎，因此在使用 时要格外小心。如果待测溶液中含有蛋白质，则因为蛋白质会在电极表面形成一薄膜，所以使用完毕后要 将电极浸泡于 0.1N HCl 中 2 小时，然后在用蒸馏水清洗，以去掉蛋白质。测量溶液酸碱值时容易发生一些实验错误，其中包括：钠离子浓度干扰 (The Sodium Error) 大部分结合电极对钠

12、离子与氢离子几乎同样敏感。钠离子的干扰于高 pH 值时尤其明显，当存在有 0.1N 钠离子时会导致酸碱值被低估 0.4 到 0.5 单位。而有一些方法可以补 救此一情形，如一些供货商提供了钠离子的校正曲线图。新的电极则设计不使钠离子通透以减低干扰。如 果以上两种方法均不可行则可用磷酸盐取代钠盐来进行实验。浓度效应 (Concentration Effects) 缓冲液中酸碱值的高低随着溶液中各种离子浓度及其他盐类之存在而不 同。这主要是因为溶液中之酸碱值主要是由离子活性 (activity) 来决定，不同的离子种类有不同活性与浓 度无关。而什么是活性呢 ?它是热动力学名词，用来定义非理想性溶液的性质。在一个无限稀释的溶液中活 性便相当于浓度。然而在有限稀释的溶液中，活性与溶质浓度便不相同。而在一般的生化实验室中我们常 常配制高浓度缓冲液或溶液，以便于实验中加以稀释使用。由于此种浓度效应在配制高浓度溶液时，调整 适当酸碱值更显重要。