序列分析软件DNAMAN 的使用方法中文

1、序列分析软件,DNAMAN,的,使用方法简介,饶志明,博士,教授,博士生导师,江南大学生物工程学院工业微生物中心,江南大学工业生物技术教育部重点实验室,E-mail,DNAMAN,是一种常用的核酸序列分析,软件。由于它功能强大，使用方便，已,成为一种普遍使用的,DNA,序列分析工具,打开,DNAMAN,可以看到如下界面,第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十,个常用主菜单,第二栏为工具栏,第三栏为浏览器栏,在浏览器栏下方的工作,区左侧，可见,Channel,工具条,DNAMAN,提,供,20,个,Channel,点击,Channel,工具条上相,应的数字，即可击活相应的,Channel,每个,

2、Channel,可以装入一个序列。将要分析,的序列,DNA,序列或氨基酸序列）放入,Channel,中可以节约存取序列时间，加快分,析速度,如何使用,DNAMAN,分析序列,1,将待分析序列装入,Channel,通过,File Open,命令打开待分析序列文件，则,打开的序列自动装入默认,Channel,通过,Sequence/Load Sequence,菜单的子菜,单打开文件或将选定的部分序列装入,Channel,通过,Sequence/Current,Sequence/Analysis Defination,命令打开,一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性,质,DNA,或蛋白质），名称，

3、要分析的片段,等参数,2,以不同形式显示序列,通过,Sequence/Display Sequence,命令打开对话框,根据不同的需要，可以选择显示不同的,序列转换形式,对话框选项说明如下,Sequence &Composition,显示序列和,成分,2,以不同形式显示序列,Reverse Complement Sequence,显示待分,析序列的反向互补序列,Reverse Sequence,显示待分析序列的反向,序列,Complement Sequence,显示待分析序列的,互补序列,Double Stranded Sequence,显示待分析序,列的双链序列,RNA Sequence,显

4、示待分析序列的对应,RNA,序列,3,DNA,序列的限制性酶切位点分析,将待分析的序列装入,Channel,点击要分析的,Channel,然后通过,Restriction/Analysis,命令打开,对话框,参数说明如下,Results,分析结果显示,其中包括,Show summary,显示概要,Show sites on sequence,在结果中显示酶切位点,Draw restriction map,显示限制性酶切图,Draw restriction pattern,显示限制性酶切模式图,3,DNA,序列的限制性酶切位点分析,Ignore enzymes with more than,忽略

5、大于某设,定值的酶切位点,Ignore enzymes with less than,忽略小于某设定,值的酶切位点,Target DNA,目标,DNA,特性,Circular,环型,DNA,dam/dcm methylation,dam/dcm,甲基化,all DNA in Sequence Channel,选择此项，在,Sequence Channel,中的所有序列将被分析，如果选,择了,Draw restriction pattern,那么当所有的,channel,中共有两条,DNA,时，则只能选择两个酶分,析，如果共有三个以上,DNA,时，则只能用一个酶分,析。,选择所需的项目，然后按提

6、示操作点击按扭，出现下,列对话框,参数说明如下,Enzyme,代表,enzyme data file,，点击旁边的下拉按钮,出现两个默认选项,restrict.enz,和,dnamane.enz,如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文,件名,其中,restrict.enz,数据文件包含,180,种限制酶,dnamane.enz,数据文件包含,2524,种限制酶,选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中,列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则,对应的酶被选中，在右边空白框中列出,要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例,如,puc18 multiple cl

7、oning sites,然后点击按钮出现下列对话框,输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可,以方便分析特定的酶切位点,Cutter,酶切识别序列长度,End,酶切产生的末端，其中包括,Blunt,平头末端,5Overhang,5,突出粘性末端,3Overhang(3,突出粘性末端,系统根据,cutter,和,end,的设定情况,在左边酶列表中显示符合条,件的酶。最后，点击按钮执行操作,4,DNA,序列比对分析,Dot Matrix Comparision,要比较两个序列，可以使用,DNAMAN,提供的序列比对工具,Dot Matrix,Comparision,点矩阵比较）通过

8、,Sequense/Dot matrix comparision,命令打开比对界面,点击对比界面左上角的按钮，出现下列,对话框,参数说明如下,Sequence type,序列类型,Sequence 1,参加比对的第一序列选择框，框内选项,说明如下,如果要比对的序列在,Channel,中，点击下拉箭头，选,择相应的,Channel,则被选中的,Channel,中的序列作,为参加比对的第一序列,也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在,File,选择,框上点击即可。通过,Length,选择参加比对的序列片,段,Sequence 2,参加比对的第二序列选择框；选项说明,同上,Show Sequence

9、,选择此项，当同源性大于设定值时,将显示同源性,Annotations,是否显示注释,Comparision,比对参数,其中,Window,代表,Window size,单位比对长度,Mismatch,代表,Mismatch size,单位比对长度中许,可的错配值）要快速比对，需将此项设为,0,Both stran,代表,Both strand,双链比对）选择此项,是指用,Sequence 2,中的序列的正链和负链分别和,Sequence 1,比较,Sequence 2,正链与,Sequence 1,比较结果用黑色点,表示,Sequence 2,负链比对结果用红色点表示,Plot box,点阵

10、图表显示参数,Position,起点坐标,Width,宽度值,Height,高度值,Frame size,边框线粗度值,Dot size,点粗度值,Gridline,虚线框数,参数设定好后，点击按钮执行操作,5,序列同源性分析,1,两序列同源性分析,通过,Sequence/Two Sequence Alignment,命令打,开对话框，如下所示,参数说明如下,Alignment method,比对方法,通常可选,Quick,快速比对,或,Smith&Waterman,最,佳比对,当选择快速比对时，设置较小的,k-tuple,值，可以提,高精确度,当序列较长时，一般要设置较大的,k-tuple,

11、值,k,tuple,值可选范围,2,6,蛋白质序列,k-tuple,值可选范围,1,3,2,多序列同源性分析,通过打开,Sequence/Multiple Sequence,Alignment,命令打开对话框,参数说明如下,File,从文件中选择参加比对的序列,Folder,从文件夹中选择参加比对的序列,Channel,从,channel,中选择参加比对的序列,Dbase,从数据库中选择参加比对的序列,Remove,清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的,序列名选择,Clear,清除全部序列,点击按钮，出现方法选择对话框,选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框,如果在前一对话框选择的是,F

12、ast alignment,则在此对话框中选,择,Quick alignment,否则选择,Dynamic alignment,即可。其,它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值,点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特,性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项,可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如,Tree/homology,tree,命令,显示蛋白质二级结构,Protein Secondary Structure,命令,绘制限制性酶切图,Restriction Analysis,命令）等,6.PCR,引物设计,首先，将目标,DNA,片段装入,Channel,

13、并激活,Channel,点击主菜单栏中的,Primer,主菜单，出现下拉菜单,点击,Design PCR Primers for DNA,命令，出现下列对话框,参数说明如下,Primer locations on target,引物定位,其中包括下列选项,Product size,扩增目的片段大小,Sense primer,正向引物选择区,Antisense primer,反向引物选择区,Primer,引物特性包括,Length,引物长度,Tm,值,GC,含量等参,数,Reject primer,引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉,包括下列选项,3dimer,可形成,3,端自我互补的碱基

14、数,Hairpin stem,可形成发卡颈环结构的碱基数,PolyN,多聚碱基,3Uique(3,端严格配对碱基数,All matches,引物互补配对百分数,Consentrations,浓度设定,Product for hybridyzat,PCR,产物用于,Southern Blot,探针杂交,7,画质粒模式图,我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章,常常需要质粒图,DNAMAN,提供强大的绘质粒图功能，能满足,我们的需要,通过,Restriction/Draw map,命令打开质粒绘图界面,将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成,I,时，单击鼠标左键，出,现如下菜单,菜单说

15、明如下,Position,当前位置,Add Site,添加酶切位点,Add Element,添加要素,Add Text,添加文字,Insert Fragment,插入片断,Copy Fragment,复制片断,Cut Fragment,剪切片断,Remove Fragment,清除片断,Frame Thickness,边框线粗细调节,点击,Add Site,选项，出现对话框,参数说明如下,Name,要添加的酶切位点的名称,例如,HindIII,Position,位置（以碱基数表示,点击,Add Element,选项，出现如下对话框,参数说明如下,Type,要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切

16、换,Color/Pattern,填充色（共有,16,种颜色供选择,Name,要素名称,Start /End/Size,要素起点,终点,粗细度,核酸序列的一般分析流程,1.1,核酸序列的检索,:80/entrez/quer,y.fcgi?db=Nucleotide,1.2,核酸序列的同源性分析,1.2.1,基于,NCBI/Blast,软件的核酸序列同源性分析,/blast/blast.cgi,1.2.2,核酸序列的两两比较,/gorf/bl2

17、.html,1.2.3,核酸序列的批量联网同源性分析,方案,1.3,核酸序列的电子延伸,1.3.1,利用,UniGene,数据库进行电子延伸,方案,1.3.2,利用,Tigem,的,EST Machine,进行电子延伸,EST Extractor,http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.ht,ml,EST Assembly,http:/www.tigem/ESTmachine.html,1.3.3,利用,THC,数据库对核酸序列进行电子延伸,http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html,1.4,核酸序列的开放阅

18、读框架分析,1.4.1,基于,NCBI/ORF finder,的,ORF,分析,/gorf/gorf.html,1.5,基因的电子表达谱分析,1.5.1,利用,UniGene,数据库进行电子表达谱分析（方,案,1.5.2,利用,Tigem,的电子原位杂交服务器进行电子表达,谱分析,http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html,1.6,核酸序列的电子基因定位分析,1.6.1,利用,STS,数据库进行电子基因定位,/geno,me/sts/epcr.cgi

19、,1.6.2,利用,UniGene,数据库进行电子基因,定位（方案,1.7 cDNA,的基因组序列分析,1.7.1,通过从,NCBI,查询部分基因组数据库进行基因组,序列的分析,方案,1.7.2,通过从,NCBI,查询全部基因组数据库进行基因组,序列的分析,/genome/seq/pa,ge.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs,1.7.3,通过从,Sanger Centre,查询基因组数据库进行,基因组序列的分析,http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.s,html,1.8,基因组序列的

20、初步分析,1.8.1,基因组序列的内含子,外显子分析,/urllists,genefind.htm,1.8.2,基因组序列的启动子分析,http:/www,/projects/promoter.html,1.9,核酸序列的注册,1.9.1 EST,序列的注册,方案,1.9.2,较长或全长,cDNA,序列的注册,方案,1.10,待分析序列所对应的已知克隆的获取,,引,物,设,计,引物,引物的重要性,引物设计的原则,引物与,PCR,引物设计软件,如何使用,Primer Premier 5.

21、0,引物同源性分析,引物,primers,引物是人工合成的两段,寡核苷酸序列，一个引,物与感兴趣区域一端的,一条,DNA,模板链互补,另一个引物与感兴趣区,域另一端的另一条,DNA,模板链互补,3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整个,PCR,体系中,引物占有十分重要的,地位,PCR,的特异性要求引物与靶,DNA,特,异结合，不与其他非目的,DNA,结合,PCR,的灵敏性要求,DNA,聚合酶能对引物进行,有效的延伸，可见引物设计好坏与,PCR,结,果密切相关,引物设计原则,引物长度,碱基分布的均衡性,Tm,值,引物二级结构,引物,3,端,

22、引物,5,端,引物的内部稳定性,引物的保守性与特异性,扩增区域的二级结构,引物长度,一般为,15-30,个核苷酸，在做长片段,PCR,或做某些特殊的,PCR,时应使用较长的引物,但最多不超过,50,个核苷酸,碱基分布的均衡性,同一碱基连续出现不应超过,5,个,GC,含量一般,40-60,GC,含量太低导致引物,Tm,值较低，使用较低,的退火温度不利于提高,PCR,的特异性,GC,含量太高也易于引发非特异扩增,引物,Tm,值,一般要求,55,65,计算,对于低于,20,个碱基的引物,Tm,值可根据,Tm=4(G+C)+2(A+T,来粗略估算,对于较长引物,Tm,值则需要考虑热动力学,参数，从“最

23、近邻位”的计算方式得到，这,也是现有的引物设计软件最常用的计算方式,Tm,H,S + R * ln (C/4) + 16.6 log,K+/(1 + 0.7 K+),273.15,引物二级结构,引物二聚体,尽可能避免两个引物分子之间,3,端有有较多,碱基互补,发夹结构,尤其是要避免引物,3,端形成发夹结构，否则,将严重影响,DNA,聚合酶的延伸,引物,3,端,引物的延伸从,3,端开始，因此,3,端的几个,碱基与模板,DNA,均需严格配对，不能进,行任何修饰，否则不能进行有效的延伸,甚至导致,PCR,扩增完全失败。考虑到密码,子的简并性，引物,3,端最后一个碱基最好,不与密码子第三个碱基配对,引

24、物,5,端,引物,5,端可以有与模板,DNA,不配对碱基,在,5,端引入一段非模板依赖性序列,5,端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切,位点,5,端加上适当数量的保护碱基,5,端的某一位点修改某个碱基，人为地在产,物中引入该位点的点突变以作研究,5,端标记放射性元素或非放射性物质（如生,物素、地高辛等,引物的内部稳定性,过去认为，引物,3,端应牢牢结合在模板上才能,有效地进行延伸，故,3,端最好为,G,或,C,现在的观点认为，引物的,5,端应是相对稳定结,构，而,3,端在碱基配对的情况下最好为低稳定,性结构，即,3,端尽可能选用,A,或,T,少用,G,或,C,仅仅,3,端几个碱基与非特异位点上

25、的碱基形成的低,稳定性结构是难以有效引发引物延伸的,如果,3,端为富含,G,C,的结构，只需,3,端几个碱基与,模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发,引物的保守性与特异性,保守性：通用引物,检测同一类病原微,生物尽可能多的型别,特异性：避免非特异性扩增,扩增区域的二级结构,模板,DNA,的某些区域具有高度复杂的二级结构,在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些,区域,扩增区域的自由能,G,小于,58.61kJ/mol,引物,Tm,值与,PCR,产物,Tm,值相差一般不超过,30,Tm,product,81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K,0.41 (%G + %C),500/length,引物与,PCR,引物浓度：一般为,0.1-0.5umol/L,引物浓度,uM)=n,OD,33,A,312,C,288,G,328,T,303-61,V,H2O,V,H2O,单位,L,退火温度,最适退火温度,Ta Opt,0.3,Tm of primer),0.7,Tm of produ