基因工程笔记总结

1、第二章 Enzymes粘性末端连接效率高于平末端约100倍!2.平末端连接1.寡核苷酸连接测定法解决方法：化平末端为粘性末端3、AMP第四节DNA连接酶Ligase一、DNA连接酶的发现二、连接条件必须是两条双链 DNA。DNA3 端有游离的-0H , 5端有一个磷酸基团 (P)。 需要能量。三、连接反应的机理1、ATP ( NAD+)提供激活的 AMP。2、ATP与连接酶形成共价“连接酶 -AMP ”复合物, 并释放出焦磷酸PP i。与连接酶的赖氨酸-氨基相连。3. 平末端连接-同聚物加尾法(1 )末端脱氧核苷酸转移酶功能：5至3单链聚合作用特点：单链；无模版作用机理：a:用5-特异的核酸外

2、切酶处理 DNA分子，以便移 去少数几个末端核苷酸，获得3 -OH的单链延伸末 端。b:加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的 反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由Poly(dA)和poly(dT)组成的DNA 单链延伸。4、AMP一条链的C：获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA5端P上，形成“ DNA-腺苷酸”复合物。5、3 -OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键,释放出AMP。Ligase :只连“ Nick 切口”，不连“ Gap 缺口”四. 两种DNA连接酶1. E. Coli DNA lig

3、ase来源：E.coli适用：粘性末端(PEG与高浓度一价阳离子存在可连 平末端)2. T4 ligase来源：T4 phage适用：粘性末端 及平末端T4 vs. E.coliT4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型 连接反应，应用更广泛！五. Ligase的反应温度最佳温度：界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15 C比较合适。六. DNA分子连接的四种形式1. 粘性末端；2.平末端；3.平末端加尾；4.平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor)(1) Digesti on and Ligati on1. 粘性末端连接Problem:(自我环化作

4、用)解决方法：a、双酶切(两种内切酶)b、去磷酸缺点：当Poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时，重组DNA分子会 有缺口。需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接 最后的缺口。4. 平末端连接-衔接物连接法与接头连接法(1) 平末端的衔接物连接法衔接物的5末端和待克隆的 DNA片段的5-末端, 用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔 接物的DNA分子和克隆载体分子。(2) 平末端的接头连接法将具有某种限制性酶 (BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。七.热稳

5、定的DNA连接酶一一来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用：寡核苷酸连接测定法(oligo nucleotide ligati on assay,OLA)连接酶链式反应 (ligation chain reaction, LCR )寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。末端补平 末端标记及随机引物标记 cDNA 第二链合成 (见 cDNA 文库构建)DNA 测序(1) 原理 : 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶 DNA 之间的杂交作用 ,这两条寡聚核苷酸探针分子在 靶 DNA 分子上的位置是彼此相邻的。三. T4 DNA 聚合酶 1. T4

6、 DNA 聚合酶特点 活性:53聚合当他们同靶 DNA 链是完全碱基配对时，便可以被连 接酶连接起来。结合点或靠近结合点处存在和靶 DNA 错配的碱基两 个探针之间不能形成磷酸二脂键。第五节 DNA聚合酶 DNA Polymerase53外切常用的 DNA1、大肠杆菌2、大肠杆菌聚合酶:DNA聚合酶IDNA聚合酶I的Klenow 大片段酶35外切高！3、T4 DNA4、T7 DNA聚合酶聚合酶5、反转录酶等。2. T4 DNA 聚合酶活性的条件 模版、引物、原料 dNTP3. T4 DNA 聚合酶的“取代合成”法末端标记四. T7 DNA 聚合酶1. T7 DNA 聚合酶特点活性:DNA聚合酶

7、I特点53聚合高！活性: 53聚合低53外切无53外切有35外切高一、大肠杆菌 DNA聚合酶I35外切2. T7 DNA 聚合酶的应用 合成:高活性，几 kb ，不受DNA 二级结构的影响DNA聚合酶I的应用一一放射性探针的标记(1)DNA聚合酶I的两种特殊反应:标记:类似 T4 (取代合成)末端补平:类似 T4切口转移与链取代(2) 切口转移法制备放射性 DNA 分子杂交探针第六节核酸修饰酶 一 . 修饰的活性:5T7 DNA 聚合酶3聚合更高(*3)！二、 Klenow 片段1、DNA聚合酶I的 Klenow片段533外切5外切无 无！活性:53聚合低修饰的 T7 DNA 聚合酶的应用:5

8、3外切无！合成能力: 更高、更快、更强！35外切低标记:重在“掺”与末端补平:Klenow片段的应用二 .激酶 (kinase) & 磷酸酶 (phosphotase)T4 多核苷酸激酶(1)特点来源: T4 噬菌体 pseT 基因编码；活性:降解单链核酸( DNA 或 RNA )为单核苷酸； 降解双链核酸的单链区(2) S1 核酸酶的应用 RNA 分子的定位2. Bal31 核酸酶Bal31 核酸酶的三种活性:( 1 )单链核酸内切( 2)双链核酸外切( 3)双链切口对应链Bal31 核酸酶主要用途:( 1 )诱发 DNA 发生缺失突变(2)定位测定 DNA 片断中限制性位点的分布3)研究超

9、盘旋 DNA 分子的二级结构活性: 5 -OH 加磷酸；(2) T4 kinase 5 末端标记的机理 用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使 5 OH 基国暴露， 同多核苷酸激酶从r-P ATP分子中转移来的r-P基团键 合，实现末端标记。(3) T4 多核苷酸激酶的应用a: 5末端标记b: 5末端磷酸化磷酸酶(1)特点来源:细菌碱性磷酸酶 (Bacterial Alkaline Phosphotase ，BAP)，E.coli ;小牛肠碱性磷酸酶(Alkaline Phosphotase, CIAP) ，小牛肠。3. 其他核酸酶外切核酸酶川(Exonucleasein): 3至5外切Calf in

10、testinal活性:5 -P 去磷酸(2) 磷酸酶作用机理催化核酸分子脱掉 5 P,使DNA 化成 5 OH 脱磷酸作用。RNA 酶 I (RNase I ):切割RNA其他核酸酶 :外切核酸酶川(ExonucleaseDNA-RNAin): 3 至杂合链中的5外切分子 5P 转DNA 酶I ( DNase I):随机切害 9 ss & dsDNAr-PA TP 和 T4这样产生的 5 OH 末端，为随后在 多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。RNA 酶I (RNase I ):切割 DNA-RNA 杂合链中的RNA(3) 磷酸酶的应用末端标记前处理 防止 DNA 分子自身环化(4)

11、 BAP 与 CIAP 比较热稳定性(65 C) BAP： active CIAP : 30min 失活第三章 Techniques 基因工程技术第七节 核酸外切酶1. 核酸外(Exonucleases)切酶Outline1、电泳2、分子杂交3、转化与转染4、核酸测序5、DNA 扩增 -PCR6、核酸 -蛋白相互作用第八节 核酸内切酶1. S1 核酸酶(1) 特点:电泳的分类:琼脂糖凝胶电泳 ( agarose gel electrophoresis)，定义 :一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核 苷酸的酶。分类:单链的核酸外切酶双链的核酸外切酶 第一节 电泳 原理:通过电场的作用使带电的

12、大分子在电泳介质中 运动。目的:根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同 的分子(依据不同的凝胶体系) 。聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ( polyaCrylamide eleCtrophoresis， PAGE)gel琼脂糖凝胶电泳( agarose gel electrophoresis)Agarose 与 PAGE 的不同： 分辨率操作应 用 ： RFLP, AFLP, DD-PCR, sequenCing, primer extension, S1 mapping, RNase proteCtion assayds-DNA目 的：分离不同长度的 DNA 片段a. 确定DNA片段的

13、长度b. 确定DNA的有无与多少C.分析酶切产物 凝胶电泳的原理 : 略 电泳步骤 第一步：制胶 第二步：样品制备 第三步：点样 第四步：跑电泳 第五步：紫外灯下检测，拍照 第六步：数据处理第二节 分子杂交一. 分子杂交概述(1) 定义分子杂交( moleCularhybridization )：不同来源的核酸 单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非 共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统 称为分子杂交技术。(2) 用途形成 DNA DNA(DNA RNA) 杂种分子，可以用来a. 检测特定生物体之间的亲缘关系。b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。缓冲体系：TAE, pH 8

14、.0, 50 mM - Tris, Acetate, EDTAC.对目的基因进行相对定量。d.对特定蛋白质进行定性及定量分析TBE, pH 8.0, 50 mM - Tris, Borate, EDTA影响迁移率的因素： 凝胶的孔径 电压DNA 片段长度及结构EB 的影响(3) 杂交的基本步骤 以核酸分子杂交为例： 凝胶电泳分离的 DNA/RNA 吸印 ,转膜 (通过毛细管作用或电导作用 )分辨率影响因素：琼脂糖浓度 缓冲液或样品的盐离子浓度 核酸上样量电压探针标记杂交检测(4). 种类Southern: DNA-DNANorthern: DNA-RNAWestern: Pr-Pr聚丙烯酰胺e

15、lectrophoresis，范围：短片段凝 胶 电 泳 ( poly-aCrylamidePAGE )分辨率： 1bpgel二 . Southern blotting1. Southern Blotting(1)目的：检测特定 DNA 序列。类型：变性胶(长度) 、 非变性胶(长度、构型) 变性胶：1、含尿素； 2、DNA 样品经甲酰胺与热处理；3、电泳保持温度。(2) 原理：电泳分离 DNA ，并将之转至尼龙膜上，以 标记好的探针( DNA )与之杂交。(3) 步骤 ProtoColsa. 基因组DNA制备b. DNA 酶切消化c. 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA片断RPA 有 Norther

16、n Blot 无法比拟的优势：d. 碱变性，中和e. 转移DNA到固相支持物(如，尼龙膜)f. 杂交反应g. 放射自显影h. 数据分析2. Other DNA analyses(1) 斑点杂交 (dot blotting) 与狭线杂交 (slot blotting)( 2)菌落与噬菌斑杂交(1) Dot blotting, slot blottlng: 将样品直接有规律地排列成点阵或线阵，然后进行杂 交检测。多用于病原体基因检测，如微生物的基因 过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应 更加完全 。RPA 比 Northern Blot 灵敏 15150倍，适合检测各种 表达水平之基因

17、。RPA 通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一 情况下的差异表达。一次 RPA 就能完成 10 多次 Northern Blot 的工作， 加 快研究速度。 主要缺点：RNA 探针的制备麻烦。 核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头， 片上什么都没有。(3) Reverse Northern blotting(2) 菌落与噬菌斑杂交 (过程略)四 . Western blotting1. Western Blotting(1)目的：检测特异性蛋白质有无及表达量。三. Northern blotting1. Northern Blotting(1)目的：检测特定序列的 RNA 的长度与

18、丰度。(2)理论依据： 抗原 -抗体特异性相互作用。(2)原理：电泳分离 以标记好的探针(RNA ，并将之转至尼龙膜上 (blot) ， DNA )与之杂交。(3)原理：电泳分离蛋白质，并将之转至膜上( blot)， 以标记好的抗体 ( antibody )与之杂交。探针”是抗体，“显色”用标记的二抗SouthernRNA 变 的 2 -羟基RNA 会被与硝酸纤维实验过程基本上同Southern blot 和 Northern blot 区别：1) RNA 分子较小，不需进行限制性内切酶切割；2) 在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使 性，而不用 NaOH ，因为它会水解 RNA 基团；3)

19、在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则 洗脱；4) 在胶中不能加 EB,因它为影响RNA 素膜的结合；5) 操作均应避免 RNase的污染。(4) 免疫应答 :略Western Blot 显色的主要方法：a. 底物化学发光ECLb. 放射自显影C.底物荧光ECFd.底物DAB (二氨基联苯胺)呈色 底物化学发光 ECL二抗用 HRP 标记，反应底物为过氧化物 +鲁米诺，底 物遇到 HRP 发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。Western analysis(2) Ribonuclease protection assay 过程：2. 分子杂交技术与细胞学的结合RNA 和探针在液体混合物中杂交(1)

20、原位杂交( in situ hybridization )与荧光原位杂交 ( Fluorescent in situ hybridization, FISH )未杂交上的 RNA 和探针被核酸酶降解，这种核酸酶 只识别单链 RNA 。杂交后的探针和 RNA 复合体通过琼脂糖凝胶电泳分 离。转膜，放射自显影。原理：标记的探针与在细胞原位的 DNA 分子杂交， 通过显色反应其相应 DNA 在细胞染色体中的具体位 置。(2) 免疫组织化学 ( immunohistochemistry )第三节 外源核酸导入细胞的方法 一.概述二. 大肠杆菌的转化三. 植物的转化(5) 脂质体( Lipofectin

21、 ) 由人工合成磷脂类双分子层的脂质体包埋 DNA ，然后 进行脂质体与细胞膜的融合(内吞) ，将外源 DNA 导 入细胞。(6) 反转录病毒 具有感染性的病毒颗粒，可以介导目的基因转染到分 裂细胞。一. 概述1. 转化 /转染( 1)转化 (Transformation) 是将外源 DNA 分子引入受 体细胞 ,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验 技术。(2) 基因转移的目的扩增重组 DNA功能表达(3) 转化与转染转染(Transfection):当细菌的转化过程中吸收的外源DNA 是病毒 DNA 时就应该称此过程为转染。二. 大肠杆菌的

22、转化1. 成功转化的必要条件(1) 感受态( CompetenCe)：a: 细菌能够获取外源 DNA 的状态。b: 特定蛋白与 DNA 结合形成可以抵御核酸酶的 复合物。(2) 复制子( repliCon )外源 DNA 稳定存在。(3) 外源 DNA 的功能表达。2. 感受态大肠杆菌的制备3. 大肠杆菌的转化-以PGLO质粒为例对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词， 而转化指正常细胞转变为癌下表过程。2.外源基因导入的方法(1) 热休克法( heat-shoCk) 影响热休克法转化效率的因素DNA ：构型、纯度、浓度受体菌： R/M 体系缺陷型；生理状态及成活率三. 植物的转化1.

23、应用2. 转化的方法3. 农杆菌介导的转化1.应用a.提高植物的农业价值和园艺价值环境:温度、 pH 、离子浓度(2) 电穿孔法 (Electroporation) 转化的原理与技术:高压电脉冲作用使细胞膜上出现小孔。b.生物反应器(蛋白/次生代谢产物)C.研究基因在发育、代谢途径中的作用电穿孔法影响因素:电压脉冲持续时间细胞类型(3 )微弹轰击法 (gene-gun) 用压缩气体(氦氮)动力，产生一种冷的气体冲击 波进入轰击室，将包裹在金属颗粒表面的外源 DNA 随金属颗粒穿过细胞壁，细胞膜，细胞质等，层层到 达细胞核。(4) 显微注射 (Microinjection)用微吸管吸取供体DNA

24、溶液，在显微镜下准确地插 入受体细胞核中的直接转移方法。2. 转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类： 一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体 法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、 PEG 介 导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和 病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法 操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植 物的遗传转化。3. 农杆菌介导的转化(一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制结构(避免内部形成二级结构& 有互补序列)植物细胞转化的双元系统GC含量主要包括两个部分：6. PCR反应的条件及过程卸甲Ti质粒，

25、由于缺失了 T-DNA区域，丧失了致瘤(1)具备的条件作用，主要是提供 Vir基因功能，激活处于反式位置总体积25-1001上的T-DNA的转移。微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T DNA左右边Buffer缓冲液界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及大肠杆菌选择标记 Lac Z基因等。dNT P原料双兀载体系统的构建的原理：是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活 T DNA的转移。P rimer引物DNA分子模板穿梭质粒定义：一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择Taq酶DNA聚合酶标记，可以在两种不同类群中存在复制。第四节基因扩增技术-PCRPCR的定义PCR技术

26、的发明PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用(2) 反应过程变性：退火：延伸：(3) PCR产物检测7. 影响PCR的因素(1) Taq DNA polymerase(2) 模板的浓度(3) dNTP酚类-(启动)-Ti质料上的Vir基因-(表达)-Vir 基因产物-(切断)-质料上的T-DNA单链；切下来 的单链T-DNA与操纵子基因产物形成复合物，转化 植物根部细胞。T-DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植 物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长 与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，是农 杆菌生长必需的物质。(二) Ti质粒转化植物细胞的战略为利用农杆

27、菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载 体系统,避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的 困难。共整合系统原理：部分T-DNA片段克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr(卡那霉素抗性)。在E.coli中，将外源基因和带有部分T-DNA片断的质粒重组，筛选重组子；将重组质粒转化到农杆菌中， 质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，侵染植物细胞。1. PCR的定义PCR技术是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法， 为最常用的分子生物学技术之一。2. PCR的发明Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。3. PCR技术的原理在微量离心管

28、中 ，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸，耐热性多聚酶，一对合成的 DNA引物。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个 阶段为一个循环。每一次循环使特异区段的基因拷贝 数放大一倍，一般样品是经过30次循环,最终使基因放 大了数百万倍。4. PCR技术的特点高度的灵敏性特异性操作简便易行用途广泛5. 引物设计长度(4) Mg2+ 浓度(5) 变性的时间(6) 退火的温度与时间(7) 延伸的温度与时间8. PCR 技术的分类传统 PCR 只扩增两个引物质之间的已知序列Sanger 测序法Sanger1977 年发明，1980 年 Nobel Prize 化学奖(1) 反向PCR把线

29、性 DNA 模板转变成环形分子。1. 原理( 1 )在 PCR 反应中，以 DNA 一条链为模板，按碱 基互补配对的原则，复制链在引物3端以 5-3方向延伸。( 2)底物是 2 -脱氧 dNTP 和一 定量 2， 3 双脱 氧ddNTP(脱氧核糖的3位置缺少一个羟基)。选择一个在已知序列中没有，而其两侧都存在的限制 性内切酶位点。用相应的限制性内切酶酶解后，将酶 切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于 环状分子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物， 以环状分子为模板进行 PCR,就可以扩增出已知序列 两侧的未知序列。(2)反转录 PCR ( RT-PCR)以 RNA 为模板 ， 经逆

30、转录获得与 RNA 互补的 DNA 链(即 cDNA) ，然后以 cDNA 链为模板进行的 PCR 反 应。(3) 梯度 PCR (gradie nt PCR )(4) 实时荧光定量 PCRCt 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数。Ct 值与起始模板每个模板的 Ct 值与其起始拷贝数的对数是线性关系SYBR 荧光染料内嵌染料 (Sybr-Greenl) ：Sybr-Greenl ，能与双链 DNA 特异结合，而不与单链 DNA 结合。未与双链 DNA 结合时荧光信号强度较低， 而当 SG 与双链 DNA 结合，荧光信号强度极大的增强。TaqMan 荧光探针：PCR 扩增

31、时在加入一对引物的同时加入一个特异性 的荧光探针；探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭 荧光基团；第五节 DNA 测序与合成一. DNA 测序目的：基因组序列测定检查基因多态性 确定新克隆的 DNAs 序列 证实需要确认的突变3) 2，3双脱氧 ddNTP 会使复制反应终止。( 4)链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞 争，使产物是一系列的核苷酸链。( 5 )在4组独立酶反应中分别采用 4种不同的 ddNTP， 结果将产生 4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链 的2.a. b. 入A、C、G或T位置。过程 引物进行放射性标记。 四种合成反应分别在不同的管中进行， 依次分别加ddGTP， d

32、dATP， ddCTP， ddTTP。c.在第一个管中， DNA 分子的合成过程中会有 G 掺 入，每一个模板 C 点对应的位点都有几率插入 ddGTP， 只要插入 ddGTP， DNA 分子延伸就会停止，而且这 一反应是随机发生的。因此就会形成一系列末端是 ddGTP 的 DNA 分子。d. 同样的过程也会发生在另外 3 个管里。e. 反应后的样品进行电泳并放射自显影分析。3步骤a. 测序胶的制备b. 模板DNA的制备，纯化c. PCR 扩增d. 点样，跑胶e. 序列分析DNA 自动化测序过程： 1、准备模板，引物， Tap 酶， dNTP 和少量用 不同标记物标记的四种 ddNTP； 2、

33、用 Sanger 测序法进行 PCR 反应，体系中会产生各 种长度不同的 DNA 片段(各片段间只相差一个碱基)3、电泳分离；4、自动化读取胶上的条带信号。测；Maxam-Gilbert 化学修饰法1. 原理用化学试剂处理末端放射性标记的 DNA 片断，造成 碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的 DNA 链的反应混合物，经凝胶电泳大小分离和反 射子显影后， 便可以根据 X 光片底板上所显现的相应 谱带， 直接读出待测 DNA 片段的核苷酸顺序。5应用：可用于检测 DNA 结合蛋白 &RNA 结合蛋白， 并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，并 可进行未知蛋白的鉴定。6. 优

34、,缺点优点：简单、快捷 缺点：确定准确结合部位比较麻烦三. DNase I 足迹实验 (可以准确确定结合部位)第六节 DNA 与蛋白质相互作用DNasel或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA包括与 DNA 相结合的蛋白质) ； 凝胶分析。二. DNA 片段的化学合成 常用方法 -亚磷酰胺三酯法概述 凝胶阻滞实验DNase l 足迹实验DMS 足迹实验 染色质免疫共沉淀 蛋白质与蛋白质相互作用 一.概述1. DNA- 蛋白质互作的意义 :a. DNA 的复制与重组b. 基因转录调控与转录后修饰2. DNA- 蛋白质互作的研究方法(1) 凝胶阻滞实验(2) DNase l 足迹实验(3) DMS 足迹

35、实验(4) 染色质免疫共沉淀二. 凝胶阻滞实验1. 原理蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种 复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢， 即表现为相对滞后。2. 步骤a.标记放射性探针并提取细胞核蛋白；b.提取物与探针进行温育，形成蛋白质-DNA复合体;1. 原理如果某个蛋白质已经与 DNA 的特定区段相结合，它 就会保证该区段 DNA 免受消化或降解作用。在电泳 凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位 不产生放射性标记的条带。2. 过程 用 32P 标记 DNA 双链末端，并用 RE 切去一端； 得到一条单链标记的 DNA 双链分子， 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育

36、； 加入适量 链发生断裂。 沉淀 DNA 进行 DNA四 . DMS 足迹实验1. 原理硫酸二甲酯( Dimethylsulfate ， DMS )：甲基化鸟嘌呤六氢吡啶：切割甲基化的鸟嘌呤DNA 特异序列结合蛋白： 阻止甲基化， 阻止切割 适量 DMS 处理完整的游离细胞，使染色质中的 G 残 基甲基化，提取 DNA 并加入六氢吡啶切割 DNA 链。 与对照的裸露 DNA 经甲基化处理后形成的梯度相对 照，就能发现 DNA 链上的蛋白质结合区。五. 染色质免疫共沉淀 (ChlP)1. 原理活细胞状态下固定蛋白质 DNA 复合物， 并将其随机 切断为一定长度范围内的染色质小片段 ;C.将混合物

37、加样到聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳将游 离的探针和已与蛋白结合的探针分离；d.放射自显影成像分析对游离型和结合型探针进行检 然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目 的蛋白结合的 DNA 片段 ;通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息 ;After ChiP PCRSouthernSequencing1. GST 融合蛋白的 Pulldown 实验第四章 基因的分离 概述定位克隆技术 基因文库的构建与筛选 差异表达基因的分析方法 cDNA 芯片技术C.克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与 BD 基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的 CDNA 文库

38、与 AD 基因构建成“猎物”基因库，共转 化酵母细胞。第七节 . 蛋白质与蛋白质相互作用（1）原理细菌表达的谷胱甘肽 S-转移酶（GST）融合蛋白作 为探针，与溶液中的特异性蛋白结合。根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀 GST 融合蛋白的 能力来确定相互作用的蛋白。2. 免疫共沉淀（1）原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的 许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀 X，那么与X在体内结 合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。第一节 概述一 . 基因克隆（ gene cloning ）1. 定义：目的基因的分离与鉴定2. 过程：1）、2）、3）、4）、选材与 D

39、NA 分子的片段化 目的片段与载体的连接 外源重组分子的导入 重组分子的筛选二 . 目的基因的分离 编码产物已知的基因 编码产物未知的基因3 酵母双杂交系统（1）原理将编码某一蛋白 X 的 DNA 序列与 DNA 结合域 BD 的 编码序列融合形成一个杂交体；将编码另一蛋白 Y 的 DNA 序列与 DNA 激活域 AD 的 编码序列融合形成另一个杂交体； 当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和丫没有相互作用， 则单独不能激活报告基因的转录； 若 X 和 Y 可相互作 用，则使 BD 和 AD 靠近形成一个有效的转录激活子， 激活报告基因的转录。通过检测报

40、告基因的转录来研 究蛋白质 X 和 丫 的相互作用。（ 2）筛选在缺少亮氨酸（LEU ）和色氨酸（TRP）的培养基上 筛选蛋白 A 和蛋白 B 能相互作用的双载体转化子。1. 编码产物已知的基因的分离 通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白 产物； 对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质 的基因序列；通过寡聚核苷酸探针或 PCR 制备的探针对文库筛选 分离目的基因。2. 编码产物未知的基因的分离 定位克隆技术 （PoSitional cloning）差异表达基因的分析方法( AnalySiS of differentiallyexpreSSed geneS)cDNA 芯片技术

41、(cDNA microarray)（ 3）用途a.已知蛋白之间相互作用的检测。基因标鉴法 (Transposon tagging)定位克隆技术b.蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作 缺失或定点突变，可检测其功能域或关键氨基酸。1). 限制性片段长度多态性( RFLP )首先基因定位，然后以紧密连锁的分子标记为起点， 通过筛选基因文库， 染色体步移逐步向目标基因靠近， 最终克隆目标基因。DNA 片DNA moleCular marker )是指可遗传 以个体间遗传物质核苷酸序 水平遗传变异的直接反映。restriction fragment lengthRFLP 标记之间差异表达基因的

42、分析方法 -差别显示技术 (differential expression)以 mRNA 为起始材料，利用 RT-PCR 技术，对差异显 示的基因带纹进行回收后作探针，在 CDNA 或基因组 DNA 文库中筛选新的基因。cDNA 芯片技术 基因标鉴法第二节 定位克隆技术 Positional cloning一.定位克隆步骤a将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上(一对紧密连锁的分子标记 )b 构建 YAC/BAC 基因组文库C 利用紧密连锁的两个分子标记作探针 , 筛选基因组 文库，构建包含目的基因的物理图谱d 筛选含连锁标记的 YAC 克隆，通过染色体移位将克 隆排序获得目标基因的 DNA

43、 片段e 通过转化和功能互补试验证实基因所在的 段。二 . 分子标记1. 定义DNA 分子标记( 并可检测的 DNA 序列， 列变异为基础，是 DNA2. 特 征 基因组 DNA 水平 可遗传 可与基因 -表型连锁3. 技术方法 限制性片段长度多态性( polymorphism ，RFLP )随机扩增 多态性( random amplified polymorphism DNA ，RAPD )扩增片段长度多 态性 ( amplified fragment length polymorphism ， AFLP ) 简单重复序列 ( Simple sequenCe repeats，SSR)DNA

44、指纹技术( DNA finger printing )(1) 技术原理： DNA 序列的变化引起酶切位点的改变， 从而使两个酶切位点间的 DNA 片段长度发生变化。基础：酶切(2) 优，缺点 优势：共显性，有利选择隐性基因； 相互独立，互不干扰 缺陷：信息含量较低，费用昂贵，操作复杂，不适用 于分析样本量较大的群体(3) 应用 构建基因组连锁图谱 亲缘关系鉴定 品种鉴定2).随机扩增多态性 (RAPD) 技术原理：以短核苷酸为随机引物 (10-12bp) ，以 DNA 为模板合 成多态性 DNA 片段。(3) 优，缺点 优势：技术简单，检测速度快；引物序列通用性强， 无需根据物种特异性分别设计

45、引物；成本较低，所需DNA 量较少缺陷： 显性标记， 不能鉴别杂合子和纯合子； 共迁移； 重复性差3). 扩增片段长度多态性 (AFLP ) 技术原理：先进行 PCR 扩增，再进行酶切，跑电泳。优势： RAPD 相比：假阳性率降低，重复性好； RFLP 相比：操作简单缺陷：基因组 DNA 质量要求高，成本高，多为显性 标记 。4).简单重复序列与 DNA 指纹技术( SSR & DNA finger printing )特性：a.高度的特异性：b .稳定的遗传性：C.体细胞稳定性：第三节 基因文库的构建与筛选 基因文库的基本概念 基因文库的构建程序 基因组文库重组克隆的排序1、 基因文库定义： 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆 的形式存在 (人工构建) 。根据构建方法的不同基因文 库分为： 基因组文库 cDNA 文库2、基因文库的构建程序a. 基因组DNA的制备b.