基因操作原理

1、基因操作原理课程教学大纲课程编码 ：13019课程名称： 基因操作原理课程英文名称先修课程 ：总学时 ：56： Princeples of Gene Manipulation 生物化学、遗传学、 分子生物学等讲课学时 56适用专业 ： 生物技术 生物科学实验学时 0 实习学时 0总学分 ：3.517一、课程性质、地位和任务“基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、入噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术；PC

2、R技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术；DNA序列分析的原理，通过 In ternet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的 基础上，掌握 DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基 因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。”分子克隆技术”是与本课程配 套的实验课程。要求学生随着科学研究二、课程基本要求 能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线， 和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、

3、遗传 学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。如果能做到理论与实验 并至，将能巩固所学知识。重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。三、教学内容及安排绪论：基因操作的理论基础 （2 学时）本章重点与难点 : 掌握与基因操作有关的基本概念 0.1 基因的概念0.1.1 什么是基因0.1.2 基因与其产物的共线性及非共线性0.1.3 基因的重叠与可变性0.2 基因的结构组成0.2.1 启动子0.2.2 SD 序列0.2.3 转录终止区0.2.4 其它0.3 基因克隆的通用策略0.3.1 基本步骤0.3.2 亚克隆第1章 基因操作工具酶 （10 学时 ）本章重点与难点 :

4、要求掌握和了解限制酶与常用工具酶的种类 知道“基因操作原理”是靠什么“工具”来完成的。1.1 限制酶 限制酶的发现及其命名 现象 限制酶的发现及其命名 限制与修饰系统的种类 限制酶识别的序列活性和用途 , 让学生1.1.1.21.1.1.31.1.21.1.2.11.1.2.2长度 结构 切割位置 特殊系列缓冲液反应温度 / 时间反应终止1.1.2.31.1.2.41.1.3 限制酶产生的末端1.1.3.1粘性末端1.1.3.2平端1.1.3.3非对称突出端1.1.3.4同裂酶1.1.3.5同尾酶1.1.4 末端长度对切割的影响1.1.5 位点偏爱1.1.5.1 现象1.1.5.2 原因1.1

5、.6 酶切反应条件1.1.6.11.1.6.21.1.6.31.1.7 星星活性1.1.8 单链DNA的切割1.1.9 酶切位点的引入 （ 酶切水平 ）1.1.9.1 方式1.1.9.2 沉默突变1.1.10 影响活性的因素1.1.11 酶切位点在基因组中分布不均一性1.2 甲基化酶1.2.1 甲基化酶的种类1.2.1.1dam/dcm 甲基化酶1.2.1.2 EcoRI 甲基化酶1.2.1.3 SssI 甲基化酶1.2.1.4 其它甲基化酶1.2.2 依赖于甲基化的限制系统1.2.3 甲基化对限制酶的酶切影响1.2.3.11.2.3.2修饰酶切位点产生新的酶切位点 甲基化位点的分布及对基因组

6、作图的影响1.2.3.31.3 DNA 聚合酶1.3.1大肠杆菌DNA聚合酶1.3.2 Klenow 酶1.3.3 T 4噬菌体DNA聚合酶1.3.4 T 7噬菌体DNA聚合酶1.3.5耐热DNA聚合酶（第7章中详细介绍）1.3.6 反转录酶1.3.7 末端转移酶1.4 其它工具酶1.4.1 RNA 聚合酶1.4.2 连接酶1.4.2.1 T 4 DNA 连接酶大肠杆菌连接酶1.4.2.11.4.2.3 Taq DNA 连接酶1.4.2.41.4.3 T 4多核苷酸酶T4 RNA 连接酶1.4.4 碱性磷酸酶1.4.5 核酸酶1.4.5.1 DNA 酶1.4.5.2 RNA 酶1.4.6 RN

7、A 酶抑制剂1.4.7 琼脂糖酶1.4.8 DNA 单链结合蛋白1.4.9 其它第2章 分子克隆载体 （14 学时 ） 本章重点与难点 : 重点掌握质粒、 因克隆的工作原理， 了解其它克隆载体， 原理。2.1. 质粒载体2.1.1 质粒的基本特性2.1.1.1入噬菌体、粘粒和 M13噬菌体的组成结构和用作基表达载体和其它功能性载体的种类及其工作的基本概念 质粒的复制和不相容性 转移性2.1.1.22.1.1.32.1.2 标记基因2.1.2.1 选择标记2.122a -互补2.1.3 质粒载体的种类2.1.3.1 克隆载体及其类群2.1.3.2 其它载体2.2入噬菌体载体2.2.1入噬菌体的分

8、子生物学2.2.1.1 发育调节2.2.1.2 可置换区2.2.2入噬菌体载体的选择标记2.2.3代表性入噬菌体载体2.2.3.1 插入型载体2.2.3.2 置换型载体2.3 粘粒载体2.3.1 粘粒的结构特征2.3.1.1 概念2.3.1.2 组成与大小2.3.2 用作基因克隆的原理性步骤2.3.3 用途2.3.4 粘粒克隆载体2.341 单-cos位点粘粒载体2.342 双cos位点的粘粒载体2.3.4.3charomid 卡隆粒 9 载体系列3.1.1 克隆中常见的问题2.4 单链丝状噬菌体载体2.4.1 M13噬菌体的生物学2.4.1.1结构组成2.4.1.2增殖过程和方式2.4.2

9、M13噬菌体载体2.4.2.1插入区域2.4.2.2M13mp载体2.4.2.3宿主菌2.4.2.4用途2.4.2.5克隆中常见的问题2.4.3 噬菌粒2.4.4 M13KO72.5 高通量克隆载体2.5.1 酵母生物学简介2.5.2 酵母人工染色体2.5.2.1 复制的必需成份2.5.2.2 选择标记2.5.2.3 筛选模型2.5.2.4 工作原理2.5.3 细菌人工染色体2.5.3.1 F 质粒生物学2.5.3.2 载体的必需成分2.5.3.3 工作原理2.5.3.4 用PBeloBACII构建苏云金芽胞杆菌2.5.4 PAC载体YBT1520全基因组文库2.5.4.1 P1噬菌体2.54

10、2 P1载体和PAC载体2.6 大肠杆菌表达载体2.6.1 非融合蛋白表达载体 2.6.1.1Lac 启动子系列 2.6.1.2Trp/tac 启动子系列2.6.1.3 启动子2.6.2 融合蛋白表达载体 2.6.2.1GST 基因融合蛋白载体 262.2 蛋白A融合蛋白载体2.6.2.3 His 融合蛋白载体2.7 其它功能性载体2.7.1 穿梭载体E.coli /gram+E.coli /yeastE.coli /plant cellE.coli /Mammalian2.7.1.12.7.1.22.7.1.32.7.1.42.7.22.7.32.7.42.7.4.12.7.4.2启动子克隆

11、载体 复制子克隆载体 整合载体无复制子整合载体 温度敏感复制子整合载体 转座子载体2.7.4.32.7.5 解离载体第3章 基因操作中的分离与分析技术 （6 学时）本章重点与难点：重点掌握大肠杆菌质粒 DNA分离纯化，琼脂糖凝胶电泳和 DNA片段回 收的方法性原理以及 RNA分离纯化的注意事项和分离及电泳方法。要求掌握印迹分析的种 类、原理和方法，特别要求掌握这些方法的运用对象，达到能灵活运用这些方法的目的。3.1 DNA 的分离3.1.1质粒DNA的分离纯化3.1.1.1小质粒的分离3.1.1.2大质粒的分离3.1.2单链DNA的分离纯化3.1.3 凝胶电泳分离 DNA3.1.3.1琼脂糖凝

12、胶电泳3.1.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳3.1.3.3脉冲电场电泳3.1.4 DNA的回收3.1.4.1低熔点琼脂糖3.1.4.2透析袋3.1.4.3 Glass milk3.1.4.4 Qiagen 柱3.1.4.5 其它3.2 RNA 的分离3.2.1 RNA 的分离纯化3.2.1.1 注意事项3.2.2.2 分离方法染色体DNA的分离 探针制备 印迹分析（杂交） 杂交3.33.43.53.5.1 Southern3.5.1.13.5.1.23.5.2 Northern3.5.2.1 RNA3.5.2.2目标DNA的转移杂交和检测 杂交 的提取和电泳 目标RNA的转移 杂交和检测3.5.2.

13、33.5.3 Western “杂交”3.5.3.1 SDS-PAGE3.5.3.2 蛋白质转移至固相支持体3.5.3.3 靶蛋白的检测3.6 基因芯片3.6.1 基因芯片3.6.1.13.6.1.23.6.1.3基因芯片的定义 基因芯片分析流程 基因芯片技术的发展史 基因芯片技术的特点3.6.1.43.6.2 基因芯片的分类3.6.2.1 Array3.6.2.2 Microarray3.6.2.3 DNA chip3.6.2.4 Lab on a chip3.6.3 基因芯片技术的理论基础3.6.3.1 DNA 分子在刚性表面的固定3.6.3.2 探针的标记3.6.3.3 杂交3.6.4

14、基因芯片的制作3.6.4.13.6.4.23.6.4.3基因的分析与选择点样 固定 芯片的应用3.6.5 DNA3.6.5.1 RNA 表达分析3.6.5.2365.3单核苷酸多态性（SNP分析3.6.5.4比较基因组分析临床检验第4章PCR技术及应用（6学时）本章重点与难点 : 要求重点掌握 PCR 技术的基本原理、基本操作程序以及引物设计方法，了解利用PCR技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作原理, 利用PCR技术为研究和应用服务。4.1 PCR 的基本原理4.1.1 PCR 运行的基本原理4.1.2热稳定DNA聚合酶的种类和用途4.1.2.1 Taq DNA 聚合酶4.122 保真热

15、稳定DNA聚合酶4.1.2.3其它热稳定DNA聚合酶4.1.3 引物的设计4.1.3.1 长短4.1.3.2 Tm 值4.1.3.3 其它4.1.4 运行程序温度时间 平台效应达到能够自觉合理地4.1.4.14.1.4.24.1.4.34.2 PCR 技术的应用4.2.1 PCR 克隆4.2.1.1 AT 克隆4. 2.1.2 平末端克隆4.2.1.3 反向 PCR4.2.2 反转录相关 PCR4.2.2.1 反转录 PCR4.2.2.2 5RACE4.2.2.3 3RACE4.2.3 PCR 鉴定和多态性4.2.3.1 PCR 鉴定4.2.3.2 RAPD4.2.3.3 AFLP4.2.4

16、实时定量 PCR4.2.4.1 实时荧光定量 PCF原理4.2.4.2 检测模式4.2.5其它PCR方式（略）4.2.5.1 PCR 介导的诱变 （ 详见后文 ）4.2.5.2 PCR 介导的DNA序列测定（详见后文）第5章 DNA序列分析（4学时）本章重点与难点：要求掌握DNA序列分析的基本原理和基本步骤 和按排测序工作； 同时要求能对所测得的序列进行常规分析 处理和分析。5.1 Maxam-Gilbert 化学降解法基本原理 优缺点 双脱氧终止法5.1.15.1.25.2 Sanger, 能够做到自行设计, 了解如何利用因特网进行数据5.2.1 测序策略5.2.1.15.2.1.2亚克隆

17、嵌套缺失克隆 “引物步进”5 .2.1.35.2.2 基本原理和步骤5.2.2.15.2.2.25.2.2.35.2.3 PCR5.2.3.1 PCR原理步骤 双链模板 自动测序反应骤，并由此掌握基因文库构建的方法和类型，6.1 基因文库6.1.16.1.26.1.36.2 cDNA概念 重组子数 注意的问题 文库5.2.3.2 自动测序和分析5.3 DNA 序列的数据分析5.3.1 目标序列的特征分析5.3.1.1酶切位点5.3.1.2 ORF 查找/ORF的特征5.3.1.3 其它（二级结构 , 启动子, SD 序列等 ）5.3.2目标序列的网络分析5.3.2.1同源性分析5.3.2.2注

18、册登记5.3.2.3已知基因序列的获得5.3.2.4两个或多个序列的同源性比较（5.3 将采用多媒体网络化演示教学 ）第6章DNA文库的构建（5学时）本章重点与难点 ：要求结合前面所学的内容，重点掌握基因文库构建的基本原理和步 可自行设计和选择构建基因文库的步骤和方法。624双链cDNA的分子克隆同聚物加尾合成的DNA接头和衔接头 其它克隆cDNA的方法 克隆的入噬菌体载体入gt10和入gt11其它6.2.4.16.2.4.26.2.4.36.2.5 DNA6.2.5.16.2.5.26.2.1 cDNA克隆的策略6.2.2 cDNA第一链的合成6.2.3 cDNA第二链的合成6.2.3.1自

19、引导法6.2.3.2第二链的置换合成法6.3.3.3第二链的引导合成6.3 基因组文库6.3.1 鸟枪克隆6.3.1.1 靶 DNA的处理6.3.1.2 载体的选择6.3.2 定向克隆6.3.2.1Southern 分析6.3.2.2 文库构建6.3.3 其它克隆方法6.3.3.1 精简基因组文库6.3.3.2 精简cDNA文库6.4 基因文库的筛选6.4.1 菌落（噬斑 ）杂交6.4.2 筛选的策略6.4.3 文库的保存 第7章 DNA定点诱变（4学时）本章重点与难点：要求学生掌握对DNA进行定点诱变所使用的方法和种类及其用途重点掌握利用寡核苷酸进行定点诱变的方法和原理。7.1 缺失与插入的形式7.1.1 简单的缺失或插入插入接头的诱变若干套嵌套的缺失突变体的产生 接头分区诱变7.2 寡核苷酸介导的诱变7.1.2 系统缺失和插入7.1.2.27