植物胚胎培养PPT演示课件

1、1,植物胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养和试管受精等内容,植物胚胎培养,2,植物胚胎结构,3,一、胚胎培养概念,1、胚胎培养 指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 广义胚胎培养研究还包括胚乳培养和试管受精等技术,4,胚电镜扫描图片,2、胚培养 指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法,5,双子叶植物胚,6,3、胚乳培养 指处于细胞期的胚乳组织的离体培养,4、胚珠培养 指未受精或受精后的胚珠离体培养,7,不同植物的胚珠形态结构,8,倒生胚珠,9,5、子房培养 指授粉和未授粉的子房培养。它对于研究果实发育的生理、离体受精等

2、有重要意义。 6、试管受精 指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉进入胚珠而完成受精过程,10,二、胚胎培养的应用,1、克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 2、打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限 3、使生活力低下或无生活力的种子萌发 4、使柑橘类植物合子胚正常发育 5、测定种子生活力 6、获三倍体或单倍体植株 7、快速繁殖特殊植物 8、用于理论研究,11,指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法,三、胚的培养,12,植物胚结构,13,胚电镜扫描图片,14,双子叶植物胚,15,16,图示为胚珠和胚囊的发育过程,孢原细胞,减数分裂,

3、大孢子母细胞,中央细胞,17,幼胚培养 成熟胚培养,据培养目的不同 剥取的离体胚发育时期的不同,胚培养,成熟胚培养一般较易获得成功,18,一）幼胚培养 幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。 幼胚培养的关键技术： 取材时期 幼胚剥离 培养条件的控制（是否需要特殊处理,19,幼胚培养时，其发育过程有以下几种发育方式： a、胚性发育，此种方式不能萌发成苗 b、早熟萌发，长成的苗十分瘦弱 c、产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚或不定芽,20,1)、胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟

4、胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株,幼胚离体培养的生长发育方式,21,2)、早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。 (3)、愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性

5、愈伤组织很容易分化形成植株,22,二）成熟胚培养 成熟胚是自养的，培养基需要简单。主要目的: 研究胚发育过程的形态建成 生长调节物质的作用 胚与胚乳相互关系和营养要求,23,培养方法： A、将受精后成熟或未成熟种子或果实，用70%75%酒精表面消毒消毒几分钟 B、用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗 C、无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上,24,荠菜不同发育时期胚培养的营养需要,25,胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。 不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植体取材时

6、期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。 胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变化，形成多倍体、非整倍体等,四、胚乳培养,26,1、核型胚乳被子植物中普遍的胚乳发育形式 初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，都不伴随壁的形成 各个胚乳核呈游离状态分布在胚囊中 发育到一定阶段后，常在胚囊外围的胚乳核之间出现细胞壁 为单子叶植物和具有离瓣花的双子叶植物中普遍存在，如小麦、水稻、玉米、棉花、油菜、苹果等,一）胚乳的发育类型,27,28,2、细胞型胚乳特点： 初生胚乳核的分裂开始，即产生细胞壁，形成胚乳细胞 无游离核时期 大多数双子叶合瓣花植物是这样的胚乳，如番茄、烟草、芝麻等,29,30,3、沼生目型胚乳

7、 核型胚乳与细胞型胚乳的中间类型 初生胚乳核的第一次分裂将胚囊分隔为两室，其中珠孔端室比合点端室宽大 核进行分裂形成状态的游离核，最后形成细胞,31,32,二）胚乳培养的关键,A、胚乳发育时期的影响 发育早期胚乳：操作不便，诱导率低 游离核期或刚转入细胞期的核型胚乳：难得callus 旺盛生长期胚乳：易诱导产生callus,33,旺盛期胚乳特征 胚已分化完成 胚乳已形成细胞组织 充分生长，达到成熟大小 外观为半透明的固体状 富有弹性,34,水稻：授粉后4 d 黑麦草：授粉后8 10 d 黄瓜：授粉后7 16 d 梨：授粉后20 d 大麦：授粉后10 20 d 玉米和小麦：授粉后8 12 d,一

8、些草本植物胚乳培养的适宜取材时期,一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低，甚至无callus 木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱导产生callus,35,B、培养基和激素的影响 培养基：MS、B5、MT、White、LS等 水解酪蛋白、酵母提取物也很必要 激素：要求特殊 大麦胚乳只有在添加2，4-D的培养基上才能生长 猕猴桃胚乳培养中，玉米素最好 枣的胚乳培养中，激素似乎无特殊要求,36,C、其他因素的影响 蔗糖浓度：3% 5% 温度：25 pH值：如 玉米 6.1 7.0 ； 苹果 6.0 6.2等,37,三） 培养方法： A、取授粉4-8d后的幼果，常规

9、消毒 B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳 C、接种在培养基上，在25-27和黑暗条件或散射光下培养形成愈伤组织 D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下不定芽 E、插入生根培养基中，光下培养10-15d，切口处长出白色的不定根,38,两种植物胚乳培养的方法 A、枸杞,开花20d的枸杞胚乳 MS + 2，4-D 0.2mg/L 生根 MS 分化出苗 MS + BA 0.2mg/L 不同倍性的胚乳植株,callus,39,B、葡萄,取出种子 切去合点部分 接种 White + CM10% + 2，4-D 2.0 + CH 500 +KT 1.0 + 蔗糖 3%4% 琼脂8% 1个月

10、，胚乳愈伤组织长大，胚解体,40,未授粉胚珠和子房培养是离体受精的基础，可诱发大孢子发育成单倍体植株，且孤雌产生的单倍体植株获得率较孤雄生殖高。 胚珠培养中，已授粉具有球形胚或更后期的胚珠易培养成种子，且培养基及添加成分相对要求不高。而受精不久的胚珠则需要成分复杂的培养基，培养难度大,五、胚珠和子房培养,41,1、胚珠培养的意义 有利于合子和早期原胚的培养 胚分化不全的种子的胚培养 获得杂交后代和优良品种 离体授粉的需要 获得无病毒苗,一） 胚珠培养,42,2、胚珠培养的方法,长度小于3mm的胚珠，难与直接解剖，可先接种于液体培养基中，根据培养情况采取相应培养条件,43,二） 子房培养,1、子

11、房培养的意义 有效地挽救杂种胚的败育 单倍体植株的培育 离体授粉的需要 离体条件形成果实 花被功能研究,44,2、子房培养的方法,授粉前或授粉后的子房,表面消毒,接种培养,45,受精后的子房仍需进行表面消毒后再接种。而未受精子房可将花被表面消毒后，在无菌条件下直接剥取子房接种。 子房培养只需较简单的培养基即可形成果实，并含成熟种子,46,六、植物离体授粉受精,离体受精（IVF） 指在离体环境中完成被子植物的精、卵融合而且利用受精所产生的“离体合子”培养再生植株，做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条件下完成。（90年代,47,离体受精技术的突破的技术前提： a、雌配子和雄配子分离技术 b、单对

12、原生质体融合技术 c、微培养技术（将商品生产的微室置入饲养细胞的小培养皿中，培养物接微室内，通过室底部微孔滤膜吸取周围饲养细胞释放的活性物质，促进其发育,48,开花前数天套袋，开花前一天或当天取花蕾或花药，表面消毒后，无菌条件下收集花粉。 采用直接引入法、注射法进行子房试管授粉，或者是采用哺育法、接近法进行胚珠试管授粉,1、离体受精方法,49,胚珠,花粉,试管内授粉,10d后,胚珠培养,3周后,离体受精及植株再生过程,50,2、技术关键,A、花粉的采集和灭菌 确定开花、花药分裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精作用时间 去雄后将花蕾套袋隔离 采集花粉粒 消毒 无菌条件分裂花粉 授粉,51,B、外植体

13、选择,开花前套袋、去雄 开花后1 2d，采集花蕾，放入无菌室培养准备 切去柱头，防止不授粉 胚珠剥离时间（开花后1 2d效果好,52,C、适合的培养基,离体受精的主要过程 花粉的萌发和花粉管的生长，受精 受精胚珠发育为成熟的种子，存在生活力的胚,培养基应促进受精后的胚珠正常发育,53,离体受精胚珠培养的改良Nitsch（1951）培养基配方,蔗糖浓度是4% 5%，水解酪蛋白为500mg/L，利于花粉萌发和种子发育,54,3、离体受精障碍,花粉在柱头上不萌发 花粉管不能进入胚珠 花粉在花柱中破裂 受精后，胚和胚乳之间的不亲和性 受精后，胚乳发育不良 杂种胚不能发育成熟,55,4、离体受精的细胞学

14、研究现状,1） 配子识别判别糖蛋白的作用 利用分离的雌、雄配子对其细胞膜特征，如表面膜蛋白 特别是糖蛋白的分布等直接进行分析，这可以帮助判断 糖蛋白在被子植物中是否和在动物及低等植物中一样是 配子识别必不可少的,56,2） 膜融合多精入卵问题的探讨 膜融合的方式，在不同的离体受精系统中融合的原理是 不同的，一种是精细胞质很快进入卵细胞，精细胞膜作 为其中的一部分参与了受精卵细胞膜的重组。另一种是 精细胞整体进入卵细胞，精细胞膜并不参与融合产物细 胞膜的形成,57,3） 胞质融合精细胞质全部进入卵细胞 体内自然受精过程中，至少部分被子植物的精细胞质未能进入卵细胞；而在离体受精时，精细胞质则全部进入卵细胞,58,4）核融合融合过程中的信号问题 核融合一般在精卵融合后35-90min出现 。烟草卵细胞有明显的