微生物检验动物实验

1、第十五章动物实验动物实验是细菌学检验的重要技术之一。一、实验动物的分类 根据实验目的不同，对实验动物要求亦不同，因此对实验动物作如下的分类。（一）遗传学控制分类1.近交系动物：近交系动物即一般称的纯系动物。此类动物是指采用兄妹交配（或亲子交配）繁殖20代以上的纯品系动物。2.突变种纯系动物：是指实验动物正常染色体中某个基因发生了变异的具有各种遗传缺陷的突变品系动物。3.纯杂种动物：是指无计划随意交配而繁殖的动物，即一般动物室供应的杂种动物。（二）微生物学控制方法分类1.无菌动物：这种动物无论体表或肠道中均无微生物存在，并且体内不含任何抗体。2.悉生动物：是给无菌动物引入已知517种正常肠道菌丛

2、培育而成的动物。3.无特殊病原体动物：又称无病动物或屏障系统动物。无任何传染病的病原体或对实验结果产生干扰的微生物存在。此种动物是标准级动物，适用于多数科研。4.清洁动物或最低限度疾病动物：该种动物是饲养在设有清洁走廊和不清洁走廓的设施中，其种群均来自剖腹产。5.常规动物：指一般在自然环境中饲养的带菌动物。二、实验动物的选择实验动物种类很多，生理性状也不同，为保证动物试验的准确性，必须选择适宜的实验动物做试验。常用的有小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔及绵羊等。通常按实验目的、要求选择实验动物，选择时应考虑如下几点：1.根据实验的要求而选择不同的实验动物：如在分离、鉴定病原菌时选用最敏感的动物作实验对

3、象。如小白鼠对肺炎链球菌、破伤风外毒素敏感、豚鼠对结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌等易感；测定金黄色葡萄球菌肠毒素以幼猫最敏感等。2.选用动物的数量必须符合统计学上预计数字的需要。3.根据实验的性质也可选不同品系的动物：其目的在于使动物试验结果有规律性、重复性和可比性。如测定对病原体的感染性，最好选用无菌动物或悉生动物。4.由于同一种实验动物存在着个体差异，还应注意个体的选择：（1）年龄：一般均选用成年动物来进行实验。动物年龄常按其体重来估计，选用的动物体重大体上小白鼠2030g、豚鼠500g左右、家兔2kg左右。（2）性别：在实验研究中，动物如无特殊需要，一般宜选用雌雄各半。（3）生理状态：实验动

4、物应证明确实健康外，雌性动物若处于怀孕、授乳期不宜采用。三、接种途径和方法包括：皮内接种：通常以背部皮肤为宜。皮下接种：选用腹壁、背部或腹股沟等处。肌肉接种：一般选用臀部和大腿部肌肉，若为禽类以胸部肌肉为宜。静脉接种：家兔以耳静脉外缘为宜，小鼠和大鼠科注射尾静脉，豚鼠科注射后腿静脉，鸡可注射翅下静脉。腹腔接种：常用于小白鼠。脑内接种：常用于小白鼠。家兔、豚鼠由于颅骨较硬，需用钢锥先打孔后注射。脚掌（垫）接种。四、接种后的观察与解剖（一）接种后的观察根据实验目的与要求，一般每天或每周观察一次。观察动物的食欲、精神状态及接种部位的变化，局部有无异常反应，周围淋巴结有无肿大等。必要时，测其体温、体重

5、及血液学指标。并将观察测定的结果记录在实验动物登记卡上。如死亡,应立即解剖或冷藏。（二）动物解剖实验动物死亡后，应及时解剖和微生物学检验。到期未死的动物，通常亦应麻醉后剖验。五、动物采血法动物采血法包括 心脏采血法：常用于家兔和豚鼠的采血。 静脉采血法：颈静脉采血常用于绵羊；耳静脉采血常用于家兔；尾静脉采血常用于小白鼠和大白鼠。 颈动脉采血法：常用于家兔的全采血。采血时注意严格消毒，避免微生物污染血液。六、动物试验在微生物检验中的应用1.分离和鉴定病原菌：有些微生物必须通过动物试验进行分离，如立克次体及某些病毒等，结核分枝杆菌的致病性也只有动物试验才能最终确定。2.细菌毒素检测:用动物试验检测

6、细菌毒素是了解病原微生物毒力和致病力的一个重要方面，常用方法有白喉棒状杆菌毒力试验、破伤风梭菌毒力保护试验、大肠埃希菌肠毒素检测。本章练习题：常用实验动物接种途径包括A.皮内接种B.皮下接种C.肌肉接种D.静脉接种E.腹腔接种答疑编号1正确答案ABCDE动物采血法包括A.心脏采血法B.皮内采血法C.静脉采血法D.肌肉采血法E.颈动脉采血法答疑编号2正确答案ACE第十六章菌种保存与管理本章考点： 1.菌种保存方法 2.菌种保管 菌种保管简述、注意事项一、保存菌种的方法保存方法适用对象保存条件和时间培养基保存法（最常用而又简易的保存方法）普通琼脂斜面保存法一般细菌4冰箱中，一般可保存一个月，每月传

7、代一次血液琼脂斜面保存法链球菌、肺炎链球菌4冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须24天移种一次，以后逐渐延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次巧克力色斜面保存法脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌35孵箱中保存，一般每2天移种一次。鸡蛋斜面保存法含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌一般4冰箱中可保存一个月。半固体穿刺保存法大多数普通细菌4冰箱保存。保存时间可达36个月干燥保存法一般细菌干燥后低温保存，可保存数年至十几年冷冻干燥保存法（目前最有效的菌种保存方法之一）一般细菌冷冻真空干燥，保存期一般35年，有的可长达10年以上液氮超低温保存法（目前保存菌种最理想的方

8、法）一般细菌其他方法难以保存二、菌种保管1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。液体培养基不适于保存菌种。2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。但应注意，一般细菌大多保存于4冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。而脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌及初次分离的流感嗜血杆菌需保存于37孵箱中。3.保存菌种应做鉴定记录。在主要培养基上生长情况、菌落特征、形态及革兰染色或特殊染色反应、生化反应、血清学性状以及个别菌种需要的动物试验结果等。4.保存的

9、菌种应有两套，一套供保存传代用，一套供实验用。5.定期转种，每转种三代作一次鉴定。6.专人保管和发放，严格保管和发放制度。本章练习题：目前最有效的菌种保存方法是A.巧克力斜面保存法B.鸡蛋斜面保存法C.半固体穿刺保存法D.干燥保存法E.冷冻真空干燥法答疑编号1正确答案E将细菌接种于琼脂半固体培养基内，置4冰箱保存。保存时间可达几个月A.13个月B.24个月C.36个月D.1个月E.3个月答疑编号2正确答案C 关于菌种保管正确的是A.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基B.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存C.保存菌种应做鉴定记录D.定期转种，每转种三代

10、作一次鉴定E.专人保管和发放，严格保管和发放制度答疑编号3正确答案ABCDE第十七章细菌检验的商品化、自动化设备本章考点：（1）微量生化反应系统（2）自动化装置 第一节微量生化反应系统一、常用的微量生化反应系统根据细菌的不同生物学性状及其代谢产物的差异，可采用多种生化反应系统鉴定细菌，现已有商品化的成套产品，它多由1024项生化指标组合而成，通过对结果的判定，得出一个37位的数据，查阅编码手册即可获得相应的细菌名称。常用的微量生化反应系统有以下几种：（一）Micro-ID系统本系统主要用于肠杆菌科的细菌鉴定。它是一块带有15个反应池的塑料板，每个反应池含有一种生化反应培养基及试剂。（二）API

11、系统（目前较常用的微量生化鉴定系统）API系统为一块塑料板，上有20个小杯，每个小杯装有不同的生化反应培养基和指示剂。API系统鉴定范围API-20E肠杆菌科细菌API-20NE非肠杆菌科细菌API Staph葡萄球菌属和微球菌属细菌API Strep链球菌属细菌API Coryne棒状杆菌属细菌API 50CHB芽胞杆菌属等革兰阳性杆菌API NH奈瑟菌属、布兰汉菌属和嗜血杆菌属细菌API Canpy弯曲菌和螺杆菌API-20A厌氧菌（三）Minitek系统该系统为带有l2个凹孔的塑料盘。包括34种生化反应培养基及指示剂的滤纸片。（四）肠杆菌-MBl2E系统该系统为一块96个凹孔的塑料板，分

12、8排。可同时鉴定8份标本。每孔含有一种干燥生化培养基，可提供12项生化反应。（五）氧化发酵鉴定系统该系统主要有氧化发酵管可应用于非发酵菌，也可用于气单胞菌等一部分发酵型细菌的鉴定。二、自动化装置（一）半自动微生物鉴定和药敏系统1.VITEKATB （Automicrobic系统） （1）原理：将肉眼观察的结果输入电脑，结果与数据库内的细菌条目比较，自动得到鉴定结果。ATB敏感试验采用半固体培养基，不同的药敏试条含有不同种类抗生素。在24小时内通过观察有无细菌生长以判断药敏试验结果。（2）操作方法：挑取1至数个纯菌落制备为0.5麦氏单位菌悬液，接种试剂条，经35孵育1824小时，观察结果。2.M

13、icroscan Panel使用测试板及快速接种系统，人工判读后将其结果输入电脑，得出结果。（二）全自动微生物鉴定和药敏系统1.VITEK系统：该系统可鉴定各种细菌（包括厌氧菌）、酵母菌及细菌的药敏试验。类型有Vitek-32及Vitek-60及Vitek（有两种规格）。仪器采用数码鉴定原理，每个鉴定卡有30项反应，每3个反应为一组，可得一组10位数的数码。Vitek采用快速荧光法测定细菌。Vitek系统有高级专家系统，对药敏结果进行解释性判读。2.MicroScan自动微生物分析系统：该系统可鉴定各种细菌（包括厌氧菌）、酵母菌及细菌的药敏试验。类型有WalkAway-40，WalkAway-

14、96。仪器应用传统呈色反应法，采用快速荧光法测定细菌。药敏部分采用比浊法进行测定。鉴定板有普通和快速两种，后者采用更为敏感的荧光底物，采用酶学方法分析。 第二节血培养系统一、半自动培养仪BACTECA60系统专用于快检血液、脑脊液、胸水及其他正常无菌体液中的细菌。将待测标本接种于含14C-底物的培养瓶中，活菌将利用14C-标记底物而产生14C02，测定气体量并换算成数值。培养瓶种类有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、L型菌培养瓶、结核菌药敏瓶等。缺点是放射性废弃物的处理较为困难。二、全自动血培养仪全自动血培养仪软件功能全，操作简便，具有数据连网共享功能。培养瓶放入仪器后即开始连续孵育、轻度震荡培养和自动

15、检测的全自动过程。1.BACTEC9000系列：包括9240型（240瓶）、9120型（120瓶）和9050型（50瓶）三种。BACTEC9000系列利用荧光探测技术（荧光增强法）：全自动连续检测培养瓶内微生物代谢引起的CO2浓度变化，而CO2浓度的改变可直接激活培养瓶底部包埋的对CO2浓度变化高度敏感的荧光物质，在二极管的激发下荧光物质释放荧光，荧光强度变化可直接反应培养瓶内CO2浓度变化。以判定是否有微生物生长繁殖，仪器每十分钟自动进行质控校正，由电脑分析判断细菌培养阴阳性，阳性者发出警报。培养瓶有标准及含树脂（有吸附抗生素作用）的需氧、厌氧瓶、儿童瓶，有真菌培养瓶、分枝杆菌培养瓶。2.BacTAlert系统：该系统为一种全自动微生物培养和监测系统，有120瓶和240瓶两种规格。培养瓶种类有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、小儿培养瓶和抗生素中和瓶等。培养瓶底部有特殊的Novel C02感应器，有半渗透性薄膜，将培养基与感应器隔离，只有C02能通过薄膜。当有微生物生长释出C02可渗透至感应器，pH改变使其颜色也改变。仪器每十分种自动检测一次，由电脑分析判断阴阳性。阳性者发