微生物检验细菌形态学检查法

1、第十章细菌形态学检查法本章考点：1.显微镜（1）普通光学显微镜（2）暗视野显微镜（3）相差显微镜（4）荧光显微镜（5）电子显微镜2.不染色细菌标本检查法3.细菌染色标本检查法（1）常用染料（2）常用染色方法细菌的形态学检查包括不染色标本检查法和染色标本检查法，显微镜是观察细菌形态所必备的基本工具。镜检不仅可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，而且根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对某些细菌，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等，通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。一、显微镜在细菌的形态学

2、检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种：1.普通光学显微镜：普通光学显微镜通常以自然光或灯光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25m，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，可将0.25m的微粒放大到0.25mm，肉眼便可以看清，一般细菌大于0.25m，故用普通光学显微镜均能清楚看到。2.暗视野显微镜：暗视野显微镜是用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，由于暗视野集光器的中央为不透光

3、的遮光板，光线不能直接射入镜筒，故背景视野黑暗无光，而从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，可以在黑暗的背景中看到发亮的菌体，犹如夜空中的明亮星星。明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。3.相差显微镜：利用相差板的光栅作用，改变直射光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的某部分结构比其他部分深暗，衬托出鲜明的对比。本法主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。4.荧光显微镜：荧光显微镜以高压汞灯产生的紫外光或蓝紫光为光源，能激发荧光物质发光使之成为可见光。细菌经荧光素染色后，置于荧光显微镜下

4、，即可激发荧光，因此在暗色的背景下可以看到发射荧光的细菌。用于细菌、病毒等的诊断或鉴别。5.电子显微镜：电子显微镜以电子流代替光源，电磁圈代替普通显微镜的光学放大系统，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨lnm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部的超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件的观察。二、不染色细菌标本的检查细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用的方法有压滴法和悬滴法，以普通光学显微镜观察。如用暗视野显微镜或相差显微镜观察，则效果更好。细菌如有动力，可看到细菌自一处移至另一处，

5、有明显的方向性位移；细菌如无动力，受水分子撞击细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。检查厌氧菌的动力要用毛细管法进行检查。除细菌标本外，螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。三、细菌染色标本的检查细菌染色标本在普通光学显微镜下可以观察细菌的形态、大小、排列、染色性、特殊结构（芽胞、荚膜、鞭毛）、异染颗粒等。因为在接近中性的环境中细菌都带有负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，故常用碱性苯胺染料如美蓝、结晶紫、碱性复红等染色细菌。（一）常用染料1.碱性染料：电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌的等电点在pH25之间，在碱性、中性、弱酸性的

6、环境中细菌均带负电荷，易与带正电荷的染料结合而着色。常用的染料有碱性复红、结晶紫、美蓝等。2.酸性染料：电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。一般情况下细菌都带有负电荷故不易着色。如果降低菌液的pH使细菌带正电荷，则可被染色。酸性染料通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。3.复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。（二）常用的染色方法细菌染色的基本程序：涂片（干燥）固定染色（初染媒染

7、脱色复染）。1.单染色法：用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色。细菌经单染色法处理后，可观察其形态、排列、大小及简单的结构，但不能显示各种细菌染色性的差异。2.复染色法：用两种或两种以上的染料染色的方法，称为复染色法或鉴别染色法。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。（1）革兰染色：本法是细菌学中最经典、最常用的染色方法。除粪便、血液等极少数标本外，绝大多数标本在分离培养之前都要进行革兰染色、镜检。意义：鉴别细菌：通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。甚至有时结合细菌特殊形态结构及排列方式，对病原菌可进行初步鉴定。选择药物参考：G+菌与G-菌

8、对一些抗生素表现出不同的敏感性。与致病性有关： 大多G+菌的致病物质是外毒素，而G-菌大多能产生内毒素，两种致病作用不同。（2）抗酸染色：抗酸染色也可将细菌分为两大类：即抗酸性细菌和非抗酸性细菌。因为临床上绝大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检查项目，只针对性用于结核病、麻风病等的细菌检查。疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后以油镜检查，即可作出初步鉴定。若查见红色抗酸杆菌，可报告为“找到抗酸分枝杆菌”。对临床疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。3.荧光染色：荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分

9、枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。如痰标本涂片、固定，用荧光染料金胺0法（也称金胺0-罗丹明B法）染色，以荧光显微镜检查，在暗背景中可观察到呈金黄色荧光的菌球。除以上所述染色方法外，用于细菌鉴定的还有鞭毛染色、异染颗粒染色等。本章练习题：用于观察细菌超微结构的显微镜是A.普通光学显微镜B.暗视野显微镜C.相差显微镜D.荧光显微镜E.电子显微镜答疑编号1正确答案E不染色标本在普通光学显微镜下主要用于检查细菌的A.形态B.动力C.结构D.大小E.排列方式答疑编号2正确答案B 不染色标本在普通光学显微镜下主要用于检查细菌的动力。常用方法有A.玻片法B.试管法C.压滴法D.划线法E.悬滴法答疑

10、编号3正确答案CE第十二章细菌的培养与分离技术本章考点：1.基本条件 （1）细菌实验室（2）无菌实验室（3）基本设备和器具2.细菌的接种与分离技术 （1）平板划线分离法（2）斜面接种法（3）液体接种法（4）穿刺接种法（5）倾注平板法（6）涂布接种法3.细菌培养的方法 （1）需氧培养法（2）二氧化碳培养法（3）厌氧培养法4.细菌的生长现象 （1）分离培养基上菌落的生长现象（2）细菌在液体培养基中的生长现象（3）细菌在半固体培养基中的生长现象5.细菌L型的检查（1）标本采集（2）培养方法细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种

11、细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。细菌经培养或分离培养后观察其生长现象，对初步识别细菌的属性很重要。一、基本条件（一）细菌实验室细菌实验室是进行细菌学实验的场所。标本的接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。所以细菌室应该符合一定的条件。1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。 2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及

12、自来水源等。4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。4.无菌室内应仅

13、限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯

14、；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。二、细菌的接种与分离技术 接种分离法用途平板划线分离法连续划线分离法主要用于杂菌不多的标本分区划线分离法适用于杂菌量较多的标本斜面接种法要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性液体接种法（避免气溶胶的产生）多用于一些液体生化试验管的接种穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。常用的有需氧培养法、二氧化碳

15、培养法和厌氧培养法。 （一）需氧培养法本法是临床细菌室最常用的培养方法，适于一般需氧和兼性厌氧菌的培养。将已接种好的平板、斜面和液体培养基等，置于35温箱中孵育1824h，一般细菌可于培养基上生长，但有些难以生长的细菌需培养更长的时间才能生长。另外，有的细菌最适生长温度是2830，如鼠疫耶尔森菌，甚至在4也能生长，如李斯特菌。（二）二氧化碳培养法有些细菌初次分离培养时须置5%l0%C02环境才能生长良好，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌，牛布鲁菌等。常以下列方法供给C02。1.二氧化碳培养箱:是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。C02从钢瓶通过培养箱的C02，运送管进入培养

16、箱内，调节好所需CO2浓度自动控制后，将接种好的培养基直接放入培养箱中培养即可。此法适于大型实验室应用。2.烛缸法:将已接种好的培养基置干燥器内，并放入点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂上凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5%l0%，然后将干燥器放入35温箱内培养。培养时间一般为1824h，少数菌种需培养37天或更长。3.化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放入干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成C02。（三）厌氧培养法适用于专性厌氧菌和兼性厌氧菌的培养。常用的厌氧培养

17、法有：疱肉培养基法；焦性没食子酸法；厌氧罐法；气袋法；厌氧手套箱法。四、细菌的生长现象（一）分离培养基上菌落的生长现象1.观察菌落：菌落的各种特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和粘度等。根据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为三型：（1）光滑型（S型）菌落（2）粗糙型（R型）菌落（3）粘液型（M型）菌落2.血琼脂上的溶血溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状；红细胞外形完整无缺。溶血：又称完全溶血，红细胞的溶解在菌落周围形成一个完全清晰透明的环。溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。

18、如产气荚膜梭菌。3.气味：通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，结合液体培养基上的性状，有助于细菌的鉴定。如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥土味）等。4.色素脂溶性色素：使菌落本身出现颜色改变。如金黄色葡萄球菌的金黄色色素。水溶性色素：使菌落周围的培养基出现颜色变化。如铜绿假单胞菌的铜绿色色素。（二）细菌在液体培养基中的生长现象浑浊生长：大多数细菌。沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观

19、察细菌的动力，有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。表现为形态多形性、染色不确定性、可滤过性、渗透压敏感性，生化反应减弱特性以及对-内酰胺类和其他作用细胞壁抗生素的抵抗性。1.标本采集:应尽量采集无杂菌污染的组织或体液标本。胸水、腹水及尿液标本，应加20%蔗糖无菌溶液，以保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。如增菌肉汤出现轻度混浊或沉淀，再分离接种于L型选择平板或血平板。2.培养方法（1）L型检查程序：将标本接种