第四章DNA损伤、修复与重组

1、第四章 DNA损伤、修复与重组 DNA damage、repair and recombination,DNA通过半保留复制的机制保证代谢上的稳定性。但稳定是相对的，从进化的角度上看，DNA是处于不断的变异和发展之中。 造成DNA变异的因素主要有： 突变（ mutation ） 基因重组（ gene recombination ） 染色体畸变,第一节 突变,突变(mutation):DNA碱基序列水平上发生的永久性的、可遗传的变异。 一、突变的类型 根据突变发生的原因： 自发突变（spontaneous ）：由于外界环境的自然作用或生物体内生理生化变化而诱发的突变（碱基错配（复制）、碱基之间的

2、互变异构、碱基脱氨基、脱嘌呤或脱嘧啶、活性氧引起的诱变） 人工诱变（Induced mutations） ：由于人工特设的诱发因素而引起的突变,根据突变的机理： 碱基对的置换（substitution）或点突变（point mutation）：一个单一碱基的改变。 转换（transition）：DNA分子中的嘌呤为另一种 嘌呤或嘧啶被另一种嘧啶取代而引起的突变； 颠换（transversion）：DNA分子中嘌呤被嘧啶所取代或嘧啶被嘌呤所取代而引起的突变,点突变的效应,无义突变（nonsense ）：使氨基酸密码子转变为终止密码子（UGA、UAG、UAA）的突变. 错义突变（missense

3、）：三联体密码子发生突变导致蛋白质中原来的氨基酸被另一氨基酸取代 同义突变（samesense ）：虽然三联体密码子发生突变，但仍然编码同一种AA,插入或缺失突变（insertions/deletions）：DNA分子中插入或缺失一个或少数几个核苷酸 突变效应： 插入或缺失几个氨基酸： 移码突变（frameshift ）：DNA分子中插入或缺失非3n个核苷酸，使整个阅读框改变而引起的突变,1.2 physical and chemical mutagens,1.2.1 physical mutagens 包括X-、-、-、- 、UV 1.2.1.1 direct functions ： ion

4、izing radiation（电离射线）：使DNA失去电子，引起DNA发生广泛的化学变化； nonionizing radiation （非电离射线）:引起原子振动或促使电子进入较高能级，导致形成新的化学键。 如UV可使DNA形成胸腺嘧啶二聚体,二、导致诱变的理化因素及其作用机制,一）物理诱变剂（physical mutagens） 包括X-、-、-、- 、UV 1、直接作用： 电离射线（ionizing radiation ）使DNA失去电子，引起DNA发生广泛的化学变化； 非电离射线（non）引起原子振动或促使电子进入较高能级，导致形成新的化学键。 如UV可使DNA形成胸腺嘧啶二聚体,2

5、、间接作用：辐射首先作用于遗传物质以外的物质，使这些物质发生变化，然后由这些变化的物质再作用于遗传物质，引起一系列的遗传学效应,Deamination-oxidation,U.V,C,U A,U.V,C C A,二）化学诱变因素（chemical,碱基类似物（base analog） 碱基修饰剂（base modifier ） 嵌入染料（intercalating dye,碱基类似物（base analogs,5-BrU： T 类似物,转换,5BrU的酮式和烯醇式具有不同的配对特性,5-BrU(k,G,5-BrU(e,C,mispairing,mispairing,T,A,5-BrU(k,5-

6、BrU(e,Replication error,Incorporation error,5-BrU(k,5-BrU(e,2氨基嘌呤的不同配对特性,亚硝酸（Nitrous acid，NA）：脱氨基作用,A C G,I C U =A X =C,羟胺（NH2OH，HA）：特殊的点突变诱变剂， 使C HC(4羟胺胞嘧啶)A，结果诱发GCAT的转换,碱基修饰剂（ base modifier,ATGC GCAT,烷化剂（alkylating agents）：一类带有单/多个不稳定的烷基，可将烷基加入到核酸上各种位点的亲电化学试剂,MMS （methylmethane sulfonate） 甲烷磺酸甲酯,A

7、TTTTTCG - -TAAAAAGC,AT EB TTTTCG- -TA,分子插入,X,AAAAGC,吖啶染料：美国癌症研究所以吖啶分子为基础，人工合成的一类诱变剂,嵌入染料（intercalating dye,5-BrU(k,G,5-BrU(e,C,5-BrU(k,定向诱变（targetted mutagenesis）：碱基类似物/碱基衍化物代替正常碱基配对后，未被修复机制纠正，导致子代将错就错地复制下去,三、定向诱变和不定向诱变,不定向诱变（untargetted mutagenesis）：大部分突变都可以作为DNA修复机制的底物，进行精确修复。但有时不能用这些精确的修复系统时，就会采用

8、转移损伤DNA合成（transition DNA synthesis），这是一类会带来差错的修复,遗传信息发生错误的原因,一些理化因子作用于DNA，改变碱基结构； DNA在复制过程中发生错配； DNA重组； 外源基因的整合,保证遗传稳定的机制-DNA修复,第二节. DNA修复（ DNA repairing,DNA的修复（DNA repairing）：是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存,DNA的改变包括两类： 单个碱基的改变Single base changes

9、 ： 双螺旋结构的异常扭曲Structural distortion,1、直接修复（direct repair） 光复活修复（photo reactivation,TT- -AA,光复活修复只能修复嘧啶二聚体,The pyrimidine dimer blocks DNA replication 高等哺乳动物该功能退化了。 例：对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境,切口的重接：DNA连接酶（ligase）修复。 烷基的转移： O6甲基-G-甲基转移酶（MGMT)， 单加氧酶(依赖于-酮戊二酸和Fe2+)(AlkB,2、切除修复（excision repair,碱基切除修复（Base excis

10、ion repair,U和烷基化的碱基可被糖苷酶( glycosylases）并直接从DNA上切除,Before Replication，暗修复,核苷酸的切除修复 (Nucleotide excision repair systems,切除包括损伤碱基的一段序列,Enzymes: 核酸内切酶 核酸外切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶,The Uvr system,3-6,522,3（3-4） 5-7,3、重组修复（recombination repair,实质：并非修复，而是“稀释,4、错配修复（mismatch repair,应急反应（SOS）：由DNA损伤或抑制复制的处理所引起的一系列复杂的

11、诱导效应。 SOS诱导的修复作用： A. error free repair（避免差错修复）：修复过程中错配碱基通常被切除，修复后DNA恢复正常。 B. error-prone repair（易错修复）：DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复,5、诱导修复和应急反应,Jean Weagle,alive 80 10 Mut. 90% 10,Damaged DNA of -phage be repaired more in E.coli A SOS repair in E. col

12、i have to be induced by U.V.（A） High frequency mutation by SOS repair（Error-prone,LexA 可抑制许多基因的表达，包括修复、recA和 lexA。 RecA激活启动了 LexA的降解，进而诱导了许多基因的表达,300 X,机制,RecA的功能,当DNA正常复制时,无复制受阻，无DNA损伤，无TT dimer,RecA不表现proteinase活性,当DNA复制受阻/ DNA damaged,能量大量消耗,当DNA复制度过难关后,SOS repair 是一种error-prone 极强的修复机制是进化中形成的“ 竭

13、尽全力，治病救人” 的措施（正常状态下，SOS是关闭的,6、 DNA损伤修复的重要性,人类遗传性疾病已经发现4000多种，其中不少与DNA修复缺陷有关，这些DNA修复缺陷细胞表现为对辐射和致癌剂的敏感性增加； 着色性干皮病（xeroderma pigmentosum）：第一个被发现的DNA修复缺陷遗传病，患者皮肤和眼睛对阳光特别是UV十分敏感，暴光部位皮肤干燥脱屑、色素沉着、容易溃疡、皮肤癌发病率高，常伴有神经系统障碍，智力低下等。病人的细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低,遗传性非息肉结肠癌（HNPCC）是由于DNA错配修复有缺陷而造成的（其中一种错配修复酶突变丢失）。该遗传病表现为：家族

14、成员是癌症高发群，许多成员患结肠癌、胃癌或子宫癌,总结：变异的形成,DNA,未经修复,经过修复 / 校正,变异是在修复过程中形成的不准确的修复,The example of how damage results mutation,第三节重组（Recombination,突变是进化的物质基础 突变（+重组） 可遗传的变异 遗传漂变（genetic drift）、 自然选择（natural selection）进化,重组是进化的必要条件,迅速增加群体的遗传多样性； 使有利突变与不利突变分开； 通过优化组合积累有意义的遗传信息,一 同源重组 (Homologous Recombination,1、定

15、义：两条同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片段交换的过程。 2、特点： 发生在同源染色体/同源序列（75bp）之间； 较大片段的交换； 交换位点可以在同源区的任何位置上； 十分精确，无核苷酸的缺失、获得和改变,3、holliday模型,两个同源染色体DNA排列整齐； 一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成连接分子，即holliday中间体； 通过分支迁移产生异源双链DNA； holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA,拼接重组体,片段重组体,如切开的链与原来断裂的是同一链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体。

16、 如切开的链非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称为拼接重组体,问题： 难以设想模型认为的两个DNA能在同一位置发生断裂,Moselson提出修正，认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一个DNA分子的同源区，造成链的置换，被置换的链再切断并与最初断链连接，即形成Holliday中间体,相应的迁移形成双个交叉,4 双链断裂启动重组,在两个交叉之间，由交换和分支迁移产生的是异源双链，由修复合成产生的是同源双链,双链断裂,产生3末端的单链,单链攻击,修复合成与链置换,被置换的链迁移到另一双螺旋,修复合成，缺口被供体序列置换,5 E.coli中与DNA同源

17、重组有关的酶,chi 位点,可被几 kb 处的双链断裂所激活 引起重组 chi 位点是 RecBCD 蛋白的靶标,5 - GCTGGTGG -3 3 - CGACCACC- 5,5.1 RecBCD产生具有自由3末 端的单链 DNA,ATP依赖的核酸外切酶活性； 被ATP增强的核酸内切酶活性； ATP依赖的解螺旋酶活性,3.1.5.2 Strand-transfer proteins catalyze single-strand assimilation,Single-strand assimilation: Strand-transfer proteins (RecA )enables a

18、single strand to displace its homologue in a duplex RecA forms filaments with single-stranded or duplex DNA and catalyzes the ability of a single-stranded DNA with a free 3 to displace its counterpart in a DNA duplex,2、RecA蛋白： 可诱发SOS反应和促进DNA单链的同化。 单链同化：指单链与同源双链分子发生链的交换，单链同化是在螺旋状纤丝中进行的,RecA蛋白介导的DNA 链

19、交换过程为： RecA蛋白与单链DNA结合形成螺旋状纤丝； 螺旋状纤丝与同源双链DNA结合； 单链DNA与双链中的互补链配对，同源链被置换出来,RuvA：识别Holliday联结体的交叉点 RuvB：六聚体解旋酶，有ATP酶活性，促进分支迁移,5.3 RuvAB促进分支迁移,10-20 bp/sec,不对称的ATTC是RuvC的识别位点和切割热点， 并决定结果是片段重组还是拼接重组,5.4RuvC特异性识别并切开Holliday联结体,2特异位点重组(site-specific recombination,Specialized recombination involves reaction

20、between specific sites that are not necessarily homologous 特点,发生在特定的短（20200bp）DNA序列内（重组位点） 有特异的酶（重组酶）和辅助因子,位点特异重组的结果依赖于重组位点的位置和方向。 如重组位点反方向存在于同一DNA链上，重组结果发生倒位。 如重组位点相同方向存在于同一DNA链上，重组结果发生切除。 如重组位点存在于不同的DNA链上，重组结果发生整合,两个倒转重复的交互重组将二者之间的序列反向排列,两个正向重复的交互重组会把二者之间的序列删除掉,O,噬菌体DNA的整合(Integration)与切除(excision

21、,3转座重组(transpositional recombination,3.1转座子(transposon,transposable element ): 可以由染色体的一个位置转移到另外一个位置的一段DNA,Barbara McClintock (86y,1983. The Nobel Prize,是基因组的一个物理实体； 有限制其在基因组内无限转座的机制； 其末端有反向重复序列 IR(inverted repeats ) 转座后在其插入位点产生正向重复序列DR(directs repeats,3.2 转座子的特点,3.3转座（transposition,转座子从基因组的一个位置转移到另一

22、位置的过程,非复制型转座(nonreplicative transposition) the transpons moves as a physical entity directly from one site to another,转座的类型,复制型转座(replicative transposition): transposons is duplicated during the reaction, so that the transposing entity is a copy of the original element,非复制性转座要经过链的断裂与重连,非复制转座中转座子仅从供体

23、位点向受体位点做物理性移动，从而在供体位点造成链的断裂，若断裂不被修复，后果将是致命的,复制性转座产生转座子的一个拷贝，由该拷贝插入到受体位点，供体位点序列不变，因此供体和受体位点都有一个拷贝的转座子,复制型转座,转座可将供体和受体融合成一个共整合体，在共整合体中，两个转座子以正向重复形式存在。共整合体以位点特异性重组方式进行拆分，拆分后每个DNA分子含有一个拷贝的转座子,非同源重组过程； 转座插入的靶位点并非完全随机(插入专一型); 转座子两侧常有IR； 靶序列在转座因子两侧会形成DR,转座的特点,引起插入突变； 在插入位置染色体重排； 影响插入位置邻近基因的表达； 染色体畸变。 插入位置上

24、出现新的基因 调节基因活动的开关 产生新的变异，有利于进化,转座引起的遗传效应,3.4、细菌转座子,3.4.1插入序列(Insertion Sequence,IS,插入序列的存在只能借助于插入位点有关基因的失活来判检测，或通过分子杂交和测序来检测,最小的转座因子,除转座酶基因外不携带任何标记基因; Is的两端都有IR，IR为转座酶识别所需，长度1525bp。 当Is转座时，宿主靶部位双链被交错切开，经修复后Is两侧形成短的DR； 靶序列通常是任意的，但交错切开的长度是固定的，一般为5bp9bp,大小2.5 kb20 kb； 具有IR、转座酶基因、调节基因、选择标记基因,Tn1（AmpR） Tn2（AmpR） Tn3（AmpR） Tn4（AmpR StrR）Tn5（KanR） Tn6（kanR） Tn7（StrR TmpR） Tn9（CamR） Tn10（TetR,3.4.2复合转座子（Tn，Complex transposons or Transposon,自主序列元件(Autonomous controlling elements): code for proteins that enable them to tr