基因突变和诱变育种课件

1、突变（ mutation ）：指生物体的表型突然发生的可遗传变化,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变,突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,依表型的改变分为： 形态突变型由突变引起的个体或菌落形态的变异。 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的

2、突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株,一）突变类型,按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分： 选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异,定义：某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率也可以

3、用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目 来表示。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（back mutant或reverse mutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定,二）突变率,三）突变的特点,适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。 自发性：突变可在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 不对应性：突变性状与突变原因之间

4、无直接的对应关系。 稀有性：突变率低且稳定。 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 可诱变性：诱变剂可提高突变率。 稳定性：变异性状稳定可遗传。 可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation,四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。 一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相

5、对应的，并认为这就是“定向变异” 另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。 从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争,变量试验又称波动试验或彷徨试验。 1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理，设计了左方的实验,1. 变量试验fluctuation test,2.涂布试验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率,涂布试验中突变率的计算,初始接种量：5 104 个/皿

6、 培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌 这时，每个平皿上的细胞数为： 5100 5 104 2.6 108个/皿 在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6 （2.6 108 5 104）= 15.6 108 在未涂布的平板上共发现28个突变，故 突变率 = 28/15.6 108 = 1.8 108,平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用,3. 平板影印培养试验（replica plating,在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用,

7、五）基因突变及其机制,基因突变的原因是多种多样的，可以是自发的或诱发的，诱变又可分为点突变和畸变。具体类型可归纳如下,1. 诱发突变,诱发突变（诱变）：通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因字符突变频率的手段。 诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂 种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。 按照遗传物质结构变化的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作用机制,1）碱基置换（substitution,对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）

8、。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。 分类：转换（transition；颠换（transversion,诱变剂即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论,直接引起置换的诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。 种类：例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。 作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异

9、。 羟胺只引起GCA : T， 其余都是可使GC=A : T发生互变的。 能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例,亚硝酸引起的AT-GC转换细节,这类诱变剂主要是一些碱基类似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等等； 作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。 以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的 的类似物 ，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BU 可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-

10、BU的插入和互变异构导致碱基置换,间接引起置换的诱变剂,5-BU引起的转换,从上图中，还可以看到5-BU的掺入引起的GC回复到AT的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。 也可以知道，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用,2）移码突变,frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一

11、类突变。 由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。 丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和-氨基丫啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂,引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。 这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似,丫啶类化合物的诱变机制,至今还不很清楚。 有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌

12、入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变,丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示,3）染色体畸变（chromosomal aberration,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，它包括： 染色体结构上的变化： 缺失（deletion） 重复（duplication） 易位（translocation） 倒位（inversion） 染色体数目的变化,染色体结构上的变化,分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。 染色体内畸变：只涉及

13、一条染色体上的变化， 如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加； 如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。 倒位-是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反； 易位-是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。 染色体间畸变：指非同源染色体间的易位,染色体畸变在高等真核生物中一般很容易观察，但在微生物中，尤其在原核生物中，还是近年来才证实的。 许多理化诱变剂的诱变作用都不是单一功能的,由40年代B. McClintock对玉米粒色素斑点变异的遗传研究而发现染色

14、体易位，自1967年以来，已在微生物和其它生物中得到普遍证实，并已成为分子遗传学研究中的一个热点。 转座：有些DNA片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。 转座因子（transposible element）：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。也称作跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（movable gene,2.自发突变机制,自发突变是指在没有人工参

15、与下生物体自然发生的突变。 产生原因： 由背景辐射和环境因素引起，如天然的宇宙射线等 微生物自身有害代谢产物的诱变效应，如过氧化氢。 （过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。它对Neurospora（脉孢菌）有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率。） 由DNA复制过程中碱基配对错误引起,发现较早和研究得较深入的是紫外线（U.V.，ultraviolet ray）的作用。 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。 紫外线的主要作用是使同链DN

16、A的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡,六）紫外线对DNA的损伤及其修复,定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。 这一现象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。最明显的是在E.coli的实验中： 对照：8106个/ml E.

17、coli U.V. 100个/ml E.coli 试验：8106个/ml E.coli U.V. 360490nm 2106个/ml E.coli 可见光，30min,光复活作用（photoreactivation,经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶（photoreactivating enzyme）即光裂合酶（photolyase）结合，当形成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。每一E.coli细胞中约含有25个光激活酶分子。

18、由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液,图:光复活作用,又称切除修复（excision repair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。这种修复作用与光无关。有四种酶参与内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5一侧切开一个3-OH和5-P的单链缺口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起逐个延长，重新合成一段缺失的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3-OH末端与原链的5-P末端相连接，从

19、而完成了修复作用,暗修复作用（dark repair,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口 2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。 3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。 4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接,设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等 紫外灯：波长为253.7nm, 功率是15W 处理时的照射距离：20cm 30cm 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm 照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量,紫外诱变方法,由于微生物接受的照射剂量与灯的

20、功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠。一定的死亡率必定对应一定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。 通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。 生产上经常采用的剂量： 死亡率为70%80%左右,二、突变和育种,一）自发突变与育种,生产过程中，微生物会以一定频率发生自发突变。富于实际经验的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。 育种工作者都希望自己能在最短的时间内培育出比较理想的变异株，因此，定向培育是微生物工作者长期来的一种理想。定向培育一般指用某一特定因素长期处理某微生物

21、的群体，以达到累积并选择相应的自发突变株的目的。这是一种古老的育种方法，与诱变育种、杂交育种尤其是与基因工程等现代育种技术相比，定向培育带有守株待兔式的被动状态,是用物理或化学的诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的,二）诱变育种,诱变育种的步骤,选择选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选,诱变育种工作中应

22、考虑的几个原则,出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株,1.出发菌株（original strain）的选择,要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag,表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落,方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤,2.处理单细胞或单孢子悬液,3.

23、诱变处理,选择简便有效的诱变剂 在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。 诱变剂的作用 提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动 剂量的表示法 致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法,单一因子处理： 复合因子处理： 两种以上因素,最适剂量的选择 产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080,诱变处理方式,4. 菌种筛选,1） 筛选方案： 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤,特殊变异菌的筛选方法,1、产量突变株的筛选（琼脂块培养法） 诱变后的分生孢子悬液均匀涂布在营养琼脂平板上，待长出稀疏的小菌落后，用打孔器一一