腺病毒中文操作手册

1、腺病毒中文操作手册12020 年 4 月 19 日文档仅供参考，不当之处，请联系改正。腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统adeasytm操作手册目 录第一章简介1增6第二章应用重组腺病毒的优点2第三章adeasytm技 术33.1技术概况33.2 adeasytm 系统中产生重组腺病毒的时程3第四 章主要流 程44.1 将基因克隆入adeasytm 转移载体44.1.1 克 隆 的 一般 原 则44.1.2 构建重组 adeasytm转移载体54.2 细菌内 adeasytm 重组子的产生54.2.1共 转 化 的 一 般 原 则54.2.2共转化方法54.2.3预期结果54.4 adea

2、sytm 重组子转染qbi-293a细胞64.4.1细胞铺板64.4.2磷 酸 钙 转 化技 术7第 五章常见 技术85.1 qbi-293a细 胞 培 养85.1.1 qbi-293a 细胞的初始培养85.1.2 qbi-293a 细胞的维持培养和增殖85.1.3qbi-293a细 胞 的 冻 存85.2 qbi-293a 细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1感 染qbi-293a细 胞95.2.2病 毒 空 斑 形 成95.2.3琼脂糖覆盖被感染细胞95.3moi测定104.3 adeasytm 重组质粒的筛选和扩5.4腺 病 毒 感 染 力 测 定1022020 年 4 月 19 日文

3、档仅供参考，不当之处，请联系改正。5.4.1x-gal染色115.8病毒 滴度测定185.5 重组腺病毒的筛选和纯化115.8.1 o.d.260nm(vp/ml)195.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和5.8.2空 斑 测 定 法20基因输送115.8.3 50%组织培养感染剂量法205.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12第六 章疑 难 解 答225.5.3western杂交136.1qbi-293a 细 胞 培 养225.5.4southern杂交和点杂交136.2感染力测定225.5.5 病 毒 裂 解 产 物 pcr 146.3转移 载体克隆235.5.6免疫测定146.4在 bj5

4、183 细胞中共转化和重组5.5.7功能测定14245.6 病毒颗粒在qbi-293a 细胞中的6.5转 染qbi-293a细 胞25大量扩增156.6筛选和测定255.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重6.7在 qbi-293a细 胞 中 表 示26组腺病毒166.8重 组 腺 病 毒 的 扩 增265.7.1不 连 续 密度 梯 度 离 心 176.9纯化265.7.2 连 续 密 度 梯 度 离 心176.10 病毒滴度测定 275.7.3病 毒 溶 液去 盐 和 浓 集 17缩写英文全称中文全称adadenovirus腺病毒amp ampicillin氨 苄 青 霉 素ad5 adeno

5、virus serotype 5 血清 5型-gal -galactosidase -半乳糖苷酶腺病毒bpbasepair碱基对adv adenoviralvector 腺病毒载体bsa bovine serum albumin 小牛血清32020 年 4 月 19日文档仅供参考，不当之处，请联系改正。白蛋白点cdna complementary dna 互补 dnacccdna closed circular coiled dna 闭环螺旋dnacpe cytopathic effect 细胞病理效应 cscl cesium chloride 氯 化 铯 dmem dulbecco modi

6、fieds eaglemediumdmem培养基dmso dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜dttdithiothreitol二 硫 苏 糖 醇edta ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸etbrethidiumbromide溴 化 乙 锭fbs fetal bovine serum 胎牛血清hrhour小时itr inverted terminal repeat 反向末minminute分钟moimultiplicityofinfection(virus/cell)感染复数mrnamessengerrna 信 使 rnamwco moiec

7、ular weight cut-offpagepolyacrylamidegelelectrophoresis聚 丙 烯 凝 胶 电 泳pbs phosphate buffered saline磷酸盐缓冲液pfu plaque forming unit 空斑形成单位pipostinfection感 染 后rcareplicationcompetentadenovirus增 殖性 腺 病 毒ritr rightinvertedterminal repeat端重复右 侧 反 向 末 端 重 复kankanamycin卡那霉素sds sodium dodecyl sulfate十二烷基kbkilob

8、ases千碱基对硫酸钠kdakilodaltons千道尔顿tbe tris borate/edta 三羟甲基氨基lb luria-bertani (broth ) lb 培养基甲 烷 硼 酸 盐 / 乙 二 胺 四 乙 酸mcs multiple cloning site 多克隆位tcid50 tissue culture infectious dose42020 年 4 月 19日文档仅供参考，不当之处，请联系改正。5050% 组 织 培 养 感 染 剂 量x-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-d-tcp total cellular protein 细胞总蛋白g

9、alactopyranoside 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -tetris/edtate溶液-d-半乳糖苷wtwildtype野 生型第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术 (一般使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒 )经过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。1953 年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了 40 多种不同血清型和93 种不同种类的腺病毒，它们一般感染眼、呼吸道或胃肠上皮（fields 等， 1996）。 1977 年， frank graham 博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（graham 等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，特别是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下