醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质.ppt

1、a,1,醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质,山西大学生科院生化教研室,a,2,一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理 二、实验原理 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状,a,3,采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电

2、泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其

3、余依次为1-、2-、-及-球蛋白,实验原理,a,4,三、实验器材,1.DYY-2型常压电泳仪：北京市六一仪器厂生产，1套/2组,a,5,操作指南：电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上，。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳压电源连接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通电，调整好电压，进行电泳。注

4、意电泳槽的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前，该电泳仪已改进为数显式的DYY-6C型,a,6,2.醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）：2片/人。 3.培养皿：一排桌子（即4组）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.点样器：一个/组。 5.滤纸：公用。 6.玻璃板：一块/组。 7.镊子：一个/组。 8.玻棒：公用,a,7,四、实验试剂,1巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，用蒸馏水定容至1000mL。 2染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。 3漂洗液：甲醇

5、或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。 4透明液（仅在定量分析时使用）：无水乙醇7份，冰醋酸3份，混匀,a,8,五、实验操作 浸泡：将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30 min方可用于点样 点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线,a,9,电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度

6、，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥,a,10,电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调节电压至160 V，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min 染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min 漂洗：将薄膜从染色液中

7、取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱,a,11,卧式水平电泳槽,a,12,六、注意事项 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果 点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为