蛋白质组学定量研究常见方法.ppt

1、a,1,蛋白质组学定量研究常见方法,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,2,蛋白质组学定量研究常见方法,1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,3,1：常规双向电泳,一、双向电泳概述： 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离，

2、第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDSPAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。 双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用。 二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势： 1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料； 2、经济实惠，可大规模多

3、个样本筛选和分析,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,4,1：双向电泳,基于2D-PAGE的经典定量分析方法。 1、样品准备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 2、蛋白质分离：蛋白质经过2D-PAGE分离后染色（银染、考染等）。 3、蛋白质的定性与定量分析：通过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化,a,5,2：DIGE,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,简介： DIGE 双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能与蛋白

4、质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。 技术优势： 1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量； 2：与常规银染相比灵敏度更高； 3：检测动态范围更大； 4：定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差； 5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差,a,6,2：DIGE,DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组

5、与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。 2、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D-PAGE电泳分离，荧光显色。 3、蛋白质定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化,a,7,3：代谢标记法15N标记法,简介： 在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。 优点： 高效性：15N标记法是体内标记技术，标

6、记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。 缺点： （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。 （2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,8,4：化学标记法ICAT,A: ICAT试剂结构，包括3个部分， SH反应集团， biotin标签，同位素臂， 试剂具有两种形式：重型（含8个氘） 和轻型（不含氘） B: ICAT标记定量

7、技术流程，来源不同 处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和 轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合， 胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标 记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰 图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段,a,9,4：化学标记法ICAT,ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复

8、杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生-消除反应使部分标签断裂,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,10,5: 化学标记法iTRAQ,简介： iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱中，信号

9、离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。 iTRAQ 结构,iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,11,5: 化学标记法iTRAQ,与传统基于双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术优势： 1：灵敏度高，检测限低，

10、可检测出低丰度蛋白； 2：分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。 3: 高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析； 4：结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠； 5：自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,12,5: 化学标记法iTRAQ,iTRAQ法。 1：样本经过不同处理后， 提取蛋白质; 2：蛋白质经过还原，封闭 后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同 的

11、iTRAQ标记; 4：等量混合各种iTRAQ试剂 标记的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,13,6: SILAC,SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg, 细胞在传代培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培养5-6代后，细胞的所有蛋白质将

12、被同位素标记，等量混合标记的蛋白质后经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。 由于SILAC标记技术是体内标记技术，几乎不影响细胞的功能，同时灵敏度高，因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的应用，如比较蛋白质组学，蛋白质与蛋白质相互作用，蛋白质与DNA相互作用，蛋白质与RNA相互作用等领域,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,14,6: SILAC,技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,a,15,6：SILAC,SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养