质粒的提取及鉴定

1、实验六质粒DNA的少量提取及鉴定,天津医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学系 辛灵彪,目的要求 了解质粒的概念。 熟悉提取质粒的基本原理。 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。,a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？,3,1.关于质粒的概念,质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。,4,超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA) 线状DNA (linea

2、r DNA, L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 （3）开环DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。,质粒的三种构型,5,质粒DNA的一般特性： (1)宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 (2)它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 (3)质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (4)它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型：菌毛、抗药性等,分离纯化质粒DNA的主要步骤,(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） (2)细菌的收集与裂解 收集方

3、法：高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。,2 提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则,原理示意图,实验原理：,高碱,细菌的细胞壁破裂，内容物释放,染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； 线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。,质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； 双链DNA并不完全分离。,纯化,RNA酶消化除

4、去RNA，并用除去残留的蛋白质,试剂盒主要试剂及作用,溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisHCl组成.(保护、缓冲) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisHCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）,10,溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) SDS是离子型表面活性剂,其主要作用是：溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，

5、所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便后续更好地进行。 NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）可瞬间溶解细胞及细菌。,11,试剂盒主要试剂及作用,溶液III：pH4.8 KAC(乙酸钾) 高盐溶液，pH调至中性 (复性，分离) 中和溶液的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。,试剂盒主要试剂及作用,吸附株纯化质粒DNA,实验步骤,1.收集4.5ml菌液于EP管，每次12000g30s 2.弃

6、上清，加含Rnase A溶液I 250 l ，剧烈振荡 3.加250l 溶液II，快速颠倒数次 4.加350l 溶液III，温和振荡10s，12000g10min 5.转移500l上清到吸附株，12000g1min 6.吸附柱中加700l漂洗液，12000g1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 7.向吸附柱中加入500l漂洗液，12000g1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 12000g2min， 8.将吸附柱敞口置于室温放置2min，挥发残余的乙醇。 9.将吸附柱放入一个干净的EP管中，向吸附膜中央悬空滴加50l经65水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000g1min。 10

7、.将此质粒DNA溶液置于-20保存。,琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 在碱性环境下，DNA的磷酸基团解离，使DNA带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。,15,3、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定,实验材料及试剂,6xloading buffer：主要成分甘油、电泳指示剂和tris.甘油主要负责沉降DNA，避免飞样。指示剂肉眼可见，确定电泳状态，一般指示剂两种，溴酚蓝呈蓝紫色，甲苯晴呈

8、蓝色。 溴化乙锭（EB）：荧光染料，可与DNA结合，在紫外光照射下呈红橙色荧光。有致癌性。 TBE:Tris，Boricacid,EDTA。核酸电泳的经典缓冲液。 琼脂糖：用1xTBE配置琼脂糖凝胶。 DNA marker,DNA Marker：是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题，以及粗略判断样品的分子量。 DNA Marker应选择在目标片段大小附近ladder较密集的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。,影响DNA在凝胶中迁移速率的因素,1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液,质粒电泳图谱

9、,实验步骤,移液器的使用,将微量液体从一个容器转移到另一个容器的计量器具，我们称之为移液器。,移液器的使用,移液循环 安装枪头 设定容量 吸液 放液 卸去枪头,移液器的使用,安装枪头,移液器的使用,原点 第一停点 第二停点,勿在液体中按至第一停点,枪头勿伸入液面太深,管壁加入,排尽液体,复位后，卸去枪头,移液器的使用,卸去枪头,无需用手接触枪头,1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、使用前请先检查溶液和溶液是否出现混浊； 8、溶液、溶液和漂洗液使用后应立即拧

10、紧盖子。 9、洗脱液不少于 50l，-20保存，以防 DNA 降解。,质粒提取注意事项：,1.凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所 以电泳前应对DNA片段大小有粗略估计。 2.加EB时，胶的温度不要太高。高温会导致EB挥 发，EB有致癌性。倒胶时避免产生气泡。 3.缓冲液要完全没过点样孔。点样孔不能有气泡。 4.紫外线照射不要太久。尤其避免直接照射皮肤。,琼脂糖电泳注意事项：,质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。,28,基因克隆示意图,分、切,接,转,筛,

11、实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术，又称基因工程。,2 BamHI 、Hind酶切质粒及鉴定,2.1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA）,33,实验七 质粒DNA质粒DNA的浓度测定与双酶切鉴定,天津医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学系 辛灵彪,1.熟悉DNA的浓度测定方法。 2.了解限制性核酸内切酶在基因工程中的应用。 3.熟悉利用限制性核酸内切酶切割质粒的方法。,目的要求,实验原理,1.质粒DNA浓度测定,1. DNA或RNA的定量

12、OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,DNA样品的浓度（g/l）= OD260稀释倍数50/1000 OD260/OD280=1.7-1.9,打开紫外分光光度计，设定波长260nm,切换至紫外。,1.质粒DNA浓度测定方法,200倍稀释样品，10l质粒加水稀释至2000l,洗净比色皿，加入待测样品。记录260nm的OD值。,设定波长280nm，记录OD值。,计算样品浓度和纯度,限制性核

13、酸内切酶 定义：能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 主要存在于细菌体内。,39,2.质粒DNA双酶切鉴定,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,限制性核酸内切酶命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,限制性核酸内切酶的切割方式,（1）20l酶切体系：取两支1.5ml的Ep管，标号，按下表加入试剂，,（2）加样后，小心混匀，置于37水浴中，酶解15min。 （3）终止酶解反应：80反应5min。 （4）琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。,实验步骤,实验步骤,质粒酶切电泳图谱,酶切反应中应注意以下几个问题